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Dec 27, 2023

Tiefseewasser verändert den Cholesterin- und Mineralstoffwechsel des Tintenfischs Todarodes pacificus und unterdrückt seinen Gewichtsverlust

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 7591 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Diese Studie ist die erste, die zeigt, dass Tiefseewasser (DOW) physiologisch signifikante Auswirkungen auf Tintenfische hat. Nach 36-stündiger Aufzucht von Tintenfischen hatten die mit DOW aufgezogenen Tintenfische im Vergleich zu den mit Oberflächenmeerwasser (SSW) aufgezogenen Tintenfischen signifikant höhere Gesamt- und freie Cholesterinwerte und eine geringere Alanintransaminase-Aktivität in der Hämolymphe. Die SSW-Aufzucht führte ebenfalls zu einem Gewichtsverlust von 6,95 %, während die DOW-Aufzucht nur zu einem Gewichtsverlust von 2,5 % führte, was möglicherweise auf eine Unterdrückung des Leberstoffwechsels zurückzuführen ist. Darüber hinaus waren sowohl einwertige (Natrium-, Chlorid- und Kaliumionen) als auch zweiwertige (Kalzium-, anorganische Phosphor- und Magnesiumionen) Ionen in der Hämolymphe bei der Aufzucht mit DOW im Vergleich zu denen bei der Aufzucht mit SSW erhöht. Eine Untersuchung der im Gehirn exprimierten Gene ergab, dass fünf Gene speziell bei der DOW-Aufzucht beobachtet wurden. Die meisten veränderten Gene waren Neuropeptide, darunter auch solche aus der Vasopressin-Superfamilie. Diese Neuropeptide sind am Cholesterin- und/oder Mineralstoffwechsel beteiligt und haben physiologische Auswirkungen auf Tintenfische. Diese Studie ist der erste Bericht über die Auswirkungen von DOW auf den Cholesterin- und Mineralstoffwechsel von Tintenfischen und wird einen Beitrag zur Aquakultur von Tintenfischen mit DOW leisten.

Tiefseewasser (DOW) ist kaltes, salziges Wasser, das sich 200 m unter der Meeresoberfläche der Erde befindet. Es zeichnet sich durch drei Hauptmerkmale aus: niedrige Temperatur (ca. 5–9 °C), reichhaltige anorganische Nährstoffe (Stickstoff, Phosphor und Silikat) und Sauberkeit (minimale bis keine Bakterienaktivität und geringere Photosynthese von Pflanzenplankton), was es für verschiedene Zwecke geeignet macht verwendet1,2. Es wurde berichtet, dass mineralische Bestandteile (Magnesiumion: Mg2+, Calciumion: Ca2+, Chromion, Vanadiumion usw.) in DOW positive Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit haben1. Beispielsweise tranken menschliche Probanden 6 Wochen lang täglich 1050 ml DOW, und Bluttests zeigten einen Rückgang des Gesamtcholesterins im Serum und des Low-Density-Lipoprotein-Cholesterinspiegels3. Darüber hinaus sanken der Gesamtcholesterin- und Triacylglycerinspiegel im Serum bei Hamstern, die mit hohem Fett-/Cholesterinspiegel gefüttert wurden4. Das in DOW enthaltene Mg2+ spielt eine wichtige Rolle im Lipidstoffwechsel1,5. DOW, ergänzt mit hohen Mg2+-Konzentrationen (341,3 mg/l), reduzierte sowohl den Triglycerid- als auch den Cholesterinspiegel im Serum und in der Leber bei Mäusen mit nichtalkoholischer Fettlebererkrankung, die mit einer fettreichen Diät gefüttert wurden5. Basierend auf einer Untersuchung von DOW an Säugetieren beeinflusst DOW den Fettstoffwechsel und besitzt gesundheitsfördernde Wirkungen.

In der Aquakultur wurde das Wachstum von Algen6,7 und Garnelen8 durch die Zucht in DOW im Vergleich zu denen, die in Oberflächenmeerwasser (SSW) gezüchtet wurden, gefördert. Die Keimwachstumsrate der Braunalge Sargassum fusiforme, die mit DOW gehalten wurde, war 2,7-mal höher als die der mit SSW7 gehaltenen. Das Wachstum juveniler Sporophyten von Eisenia arborea und Eisenia cava, die mit DOW gezüchtet wurden, war ebenfalls schneller6. Die in der Tiefsee lebenden pelagischen Garnelen Sergia lucens können bei Aufzucht mit DOW8 lange gehalten werden; es konnte im Durchschnitt nur 13 Tage mit SSW und 58,8 Tage mit DOW aufbewahrt werden. Mit DOW8 konnten die Garnelen bis zu 185 Tage gehalten werden.

Todarodes pacificus (Abb. S1), der Japanische Tintenfisch, ist in den Oberflächen- und Mittelschichten küstennaher Gewässer vom Ochotskischen Meer nördlich bis zum Japanischen Meer und Ostchinesischen Meer verbreitet. Dieser Tintenfisch ist in Japan und im asiatischen Raum am gefragtesten. Es wird nicht nur frisch, sondern auch in verschiedenen verarbeiteten Lebensmitteln wie Surume (getrockneter Tintenfisch) und Shiokara (gesalzener Tintenfisch) verwendet. Allerdings ist die Technologie zur Aufzucht dieses Tintenfischs noch nicht entwickelt.

Unsere aktuelle Studie ergab, dass DOW den Stress von Meeresfischen (japanische Flunder Paralichthys olivaceus) reduzierte, die unter Bedingungen hoher Dichte gezüchtet wurden9. In der Studie wurde Kynurenin, ein in DOW vorkommender Bestandteil, als verantwortlicher Faktor für die stressreduzierende Wirkung von DOW9 identifiziert. Diese Ergebnisse legen die positive Wirkung von DOW auf die physiologischen Eigenschaften des Tintenfischs nahe. Um diese Möglichkeit zu testen, verglich die aktuelle Studie Veränderungen in der Hämolymphzusammensetzung und mRNA-Expression im Gehirn sowie im Körpergewicht zwischen DOW- und SSW-aufgezogenen Tintenfischen bei identischer Wassertemperatur.

Die Gesamtprotein- (TP), Albumin- (ALB) und Glukosespiegel (GLU) in der Hämolymphe von Tintenfischen veränderten sich zwischen DOW- und SSW-Aufzucht nicht (Abb. 1), während der Cholesterinstoffwechsel signifikant verändert war. Die Gesamtcholesterin- (T-CHO) und freien Cholesterinspiegel (F-CHO) in der Hämolymphe von Tintenfischen, die mit SSW aufgezogen wurden, waren signifikant niedriger als bei denen, die mit DOW aufgezogen wurden, obwohl sich das Cholesterin vom Estertyp (E-CHO) nicht signifikant veränderte ( Abb. 1). Zumindest unter den gegenwärtigen Bedingungen wurden in der Hämolymphe des Tintenfischs keine Triglyceride nachgewiesen. Diejenigen, die mit DOW aufgezogen wurden, hatten im Vergleich zu denen, die mit SSW aufgezogen wurden, eine signifikant geringere Hämolymph-Alanin-Transaminase-Aktivität (ALT) (Abb. 2). Es wurde kein signifikanter Unterschied in den Aktivitäten der Hämolymphaspartattransferase (AST) und Kreatinkinase (CK) von Tintenfischen festgestellt, die mit DOW und SSW gehalten wurden (Abb. 2). Darüber hinaus sind in Tabelle S1 Veränderungen des Körpergewichts vor und nach der Aufzucht in SSW oder DOW aufgeführt. Interessanterweise verursachte die DOW-Aufzucht nur einen Gewichtsverlust von 2,5 %, während die SSW-Aufzucht zu einem Gewichtsverlust von 6,95 % führte.

Veränderungen des Gesamtproteins (TP) (g/dl) (A), des Albumins (ALB) (g/dl) (B), der Glukose (GLU) (mg/dl) (C), des Gesamtcholesterins (T-CHO) ( mg/dL) (D), freies Cholesterin (F-CHO) (mg/dL) (E) und Cholesterin vom Estertyp (E-CHO) (mg/dL) (F) in der Hämolymphe nach Aufzucht von Tintenfischen mit SSW ( Weißer Balken, n = 9) oder DOW (Schwarzer Balken, n = 10). *P < 0,05.

Veränderungen der Aktivitäten von Aspartat-Transaminase (AST) (IU/L) (A), Alanin-Transaminase (ALT) (IU/L) (B) und Kreatinkinase (CK) (IU/L) (C) in der Hämolymphe nach der Aufzucht Tintenfische mit SSW (weißer Balken, n = 9) oder DOW (schwarzer Balken, n = 10). **P < 0,01.

Einwertige Ionen (Na+, Cl− und K+) und zweiwertige Ionen (Mg2+ und Ca2+) in SSW und DOW zeigten nahezu die gleichen Werte (Tabelle S2). Allerdings waren die Na+-, Cl−- und K+-Werte in der Hämolymphe von Tintenfischen, die mit DOW aufgezogen wurden, signifikant höher als bei denen, die mit SSW aufgezogen wurden (Abb. 3A–C). Die Konzentration von Hämolymphe Mg2+ war bei mit DOW aufgezogenen Tintenfischen deutlich höher als bei mit SSW aufgezogenen Tintenfischen (Abb. 3D). Im Fall von Ca2+ war der Hämolymph-Ca2+-Gehalt von Tintenfischen, die in DOW aufgezogen wurden, tendenziell höher als der von Tintenfischen, die in SSW aufgezogen wurden (Abb. 3E). Der Gehalt an anorganischen Phosphorionen (iP) in der Hämolymphe war bei Tintenfischen, die mit DOW gehalten wurden, signifikant höher als bei Tintenfischen, die mit SSW aufgezogen wurden, was auch bei Mg2+ der Fall war (Abb. 3F).

Änderungen in Na+ (mEq/L) (A), Cl− (mEq/L) (B), K+ (mEq/L) (C), Mg2+ (mg/dL) (D), Ca2+ (mg/dL) ( E) und iP (mg/dl) (F) in der Hämolymphe nach Aufzucht von Tintenfischen mit SSW (weißer Balken, n = 9) oder DOW (schwarzer Balken, n = 10). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001.

Variationen in der Expression (Vulkandiagramm) in den Gehirnen von Tintenfischen, die mit SSW und DOW aufgezogen wurden, sind in Abb. 4A dargestellt. Transkript-IDs mit signifikanten Änderungen zwischen SSW und DDW (LogFC > 5,0 und Falscherkennungsrate [FDR] > 10−6) sind in Abb. 4A dargestellt. In DOW gezüchtete Tintenfische wiesen Veränderungen in den im Gehirn exprimierten Genen auf.

Veränderungen der Genexpression im Tintenfischhirn nach der Aufzucht von Tintenfischen mit SSW oder DOW. (A) Vulkandiagramm im Gehirn von Tintenfischen nach der Aufzucht mit SSW oder DOW. In den Gehirnen von mit DOW aufgezogenen Tintenfischen werden Transkript-IDs mit einer log2-fachen Änderung > 5,0 und einer Falscherkennungsrate (FDR) > 10−6 angezeigt. (B) Heatmap und hierarchische Clusterbildung durch unterschiedlich exprimierte Gene (P < 0,001) zwischen SSW- und DOW-Bedingungen.

Abbildung 4B zeigt eine Heatmap mit hierarchischer Clusterbildung, die von Trinity Utility erstellt wurde. Basierend auf einer hierarchischen Clusteranalyse fanden wir 50 Gene, deren Expression je nach DOW- und SSW-Aufzucht signifikant variierte (Tabelle S3). Unter diesen Genen befanden sich fünf Protein-kodierende Gene, deren Aminosäure-kodierende Regionen abgeleitet werden konnten. Eines war ein unbekanntes Gen mit unbekannter Funktion, während die anderen vier Neuropeptide waren (Oegopressin 1 und 2: Abb. 5A; Achatin-verwandtes Peptid: Abb. 5B; Elevenin-ähnliches Peptid; Abb. 5C). Alle diese Neuropeptid-Gene wurden bei der Aufzucht mit DOW hochreguliert (Abb. 4B).

Oegopressine (A), Achatin-verwandtes Neuropeptid (B) und Elevenin-ähnliches Peptid (C) des japanischen Tintenfischs. (A) Vorhergesagte Aminosäuresequenzen von Oegopressin 1 und 2. Rote Schrift, mutmaßliches reifes Peptid; blaue Schrift, mutmaßliche Peptidase-Spaltstellen; gelbe Markierung, mutmaßliches Signalpeptid; rote Markierung, konservierte Cysteinreste für die S-S-Bindungsbildung; Jede Unterstreichung zeigt die Sequenz des vorhandenen Neurophysins nach dem reifen Peptid. (B) Vorhergesagte Aminosäuresequenzen von Todarode-Achatin-verwandten. Rote Schrift, mutmaßliches reifes Peptid; blaue Schrift, mutmaßliche Peptidase-Spaltstellen; gelbe Markierung, mutmaßliches Signalpeptid. (C) Vorhergesagte Aminosäuresequenzen von Todarode-Elevenin-like. Rote Schrift, mutmaßliches reifes Peptid; blaue Schrift, mutmaßliche Peptidase-Spaltstellen; gelbe Markierung, mutmaßliches Signalpeptid; Rote Markierung, konservierte Cysteinreste für die Bildung von S-S-Bindungen.

Diese Studie ist die erste, die zeigt, dass DOW physiologisch signifikante Auswirkungen auf den japanischen Tintenfisch T. pacificus hat. Nach 36-stündiger Aufzucht von Tintenfischen wiesen die mit DOW aufgezogenen Tintenfische im Vergleich zu den mit SSW aufgezogenen Tintenfischen signifikant höhere T-CHO- und F-CHO-Werte und eine geringere ALT-Aktivität in der Hämolymphe auf (Abb. 1). Auch die ALT-Aktivität, ein Lebermarker10,11,12, nahm in der DOW-Aufzucht ab (Abb. 2), was darauf hindeutet, dass der Leberstoffwechsel reduziert war und der Hämolymphcholesterinspiegel hoch blieb. Zusätzlich wurden ihre Gewichte vor und nach dem Experiment gemessen (Tabelle S1). Das Durchschnittsgewicht von neun mit SSW aufgezogenen Tintenfischen verringerte sich von 148,2 auf 137,9 g, während sich das Durchschnittsgewicht der mit DOW aufgezogenen Tintenfische von 148 auf 144,3 g änderte, was auf eine geringfügige prozentuale Gewichtsreduzierung (– 2,5 %) hinweist. Diejenigen, die mit DOW aufgezogen wurden, hatten einen geringeren Gewichtsverlust durch die Unterdrückung des Leberstoffwechsels. Andererseits sanken ihre Hämolymph-AST- und CK-Werte, die Marker für Herz- und Skelettmuskeln sind11,13,14,15, nicht signifikant, möglicherweise weil sie ihre Muskeln ständig zum Schwimmen bewegten.

In dieser Studie beeinflusste die DOW-Aufzucht den Mineralstoffwechsel bei Tintenfischen. Sowohl einwertige (Na+, Cl− und K+) als auch zweiwertige Ionen (Mg2+ und Ca2+) in der Hämolymphe waren bei der Aufzucht mit DOW im Vergleich zu denen, die mit SSW aufgezogen wurden, erhöht (Abb. 3). Andere Mineralionen als Ca2+ waren nach der DOW-Aufzucht deutlich erhöht (Abb. 3). Da Ca2+ eine wichtige Rolle bei der neuronalen Aktivität von Tintenfischen spielt16,17, könnte dieses Ion durch einen anderen Mechanismus reguliert werden.

Eine Untersuchung der im Gehirn exprimierten Gene ergab, dass fünf Gene speziell bei der DOW-Aufzucht beobachtet wurden (Abb. 4 und 5). Die meisten veränderten Gene waren Neuropeptide, einschließlich der Oegopressin-Superfamilie, des Achatin-verwandten Peptids und des Elfin-ähnlichen Peptids, was darauf hindeutet, dass sie signifikante physiologische Auswirkungen auf Tintenfische haben.

Bei der Octopus-Art wurden zwei Peptide von Octopressin und Cephalotocin, einschließlich der Vasopressin/Oxytocin-Superfamilie, aus dem Rektum- bzw. Nervengewebe von Octopus vulgaris isoliert und identifiziert18,19. Wir stellten fest, dass zwei Peptide zur Vasopressin/Oxytocin-Superfamilie gehörten (Abb. S2 und Tabelle S4). Der Sequenzabgleich durch MAFFT zeigte, dass unsere ermittelten Peptide aus neun Aminosäureresten bestanden, die Konsensus-Cysteinreste sowie andere bilaterale Vasopressin/Oxytocin-Peptide enthielten (Abb. 6A). Da diese Art von Peptiden die ersten sind, die bei Tintenfischen mit offenen Augen (Oegopsiden) entdeckt wurden, nennen wir sie Oegopressin. Die vorliegende Studie ist der erste Bericht, der die Expression von Oegopressinen in Tintenfischen zeigt. Es war bekannt, dass sich die Octopressin- und Cephalotocin-Gene wie die Vasopressin/Oxytocin-Familie durch Duplikation entwickelt haben20. Beide Peptide in dieser Studie zeigten einen ähnlichen Grad an Homologie im Vergleich zum bisher bekannten Conopressin (Lymnaea stagnali: Nr. 1, Abb. 6B). Die drei bisher bekannten Cephalotocine (Nr. 11, 12 und 13, Abb. 6B) haben ein zweites Phenylalanin und ein drittes Tryptophan, aber keines der in dieser Studie gefundenen Peptide ist mit diesen identisch. Daher kamen wir zu dem Schluss, dass es sich bei beiden neuen Todarodes-Peptiden um Octopressin-Homologe handelt, und bestimmten Oegopressin 1: CFFRNCPPG (Nr. 6, Abb. 6B) und Oegopressin 2: CYFRNCPAG (Nr. 10, Abb. 6B) in Tintenfischen. Ob andere Tintenfischarten außer dem Gemeinen Tintenfisch ein separates Cephalotocin-Homolog haben, wird in Zukunft weitere Untersuchungen der Genomsequenz bei weiteren Arten erfordern.

Logodarstellung (A) und Sequenzausrichtung reifer Peptide (B) Neuropeptide der Vasopressin/Oxytocin-Superfamilie. (A) Logo-Darstellung von Neuropeptiden der Vasopressin/Oxytocin-Superfamilie basierend auf einem Sequenz-Alignment der Top-50-Homologen durch webBLASTP zu Oegopressin 1 und 2. Rot unterstrichen, mutmaßliches reifes Peptid; blaues Rechteck, mutmaßliche Peptidase-Spaltstellen. (B) Sequenzausrichtung reifer Peptide ausgewählter Vasopressin/Oxytocin-Homologe aus Mollusken.

Beide kodierenden Sequenzen sind durch das Vorhandensein einer zusätzlichen funktionellen Neurophysin-Sequenz hinter dem reifen Peptid gekennzeichnet (jeweils unterstrichen in Abb. 5A). Beim Oktopus Octopus vulgaris wurden sowohl Octopressin- als auch Cephalotocin-mRNA im Gehirn der Speiseröhre exprimiert19. Diese Tatsache stimmt mit unseren RNA-Sequenzierungsergebnissen überein. Nach eintägiger Verabreichung von Octopression an Tintenfische verringerten sich die Osmolalität der Hämolymphe und die Ca2+-Konzentrationen21. Wie oben beschrieben, könnte die Tatsache, dass nur das Ca2+ in der Hämolymphe im Gegensatz zu den anderen Ionen bei der Aufzucht mit DOW nicht signifikant erhöht war, etwas mit der Wirkung der Oktopression zu tun haben.

Achatin-I, ein Tetrapeptid (Gly-d-Phe-Ala-Asp), wurde aus den subösophagealen und zerebralen Ganglien der afrikanischen Riesenschnecke Achatina fulica Férussac22 gereinigt und bestimmt. Dieses Peptid hatte eine Bioaktivität und rief eine starke neuroexzitatorische Wirkung hervor, obwohl Gly-l-Phe-l-Ala-l-Asp, genannt Achatin-II, auf die Neuronen der Afrikanischen Riesenschnecke unwirksam war22,23. Die mRNA-Expression dieses Peptids nahm im Gehirn von Tintenfischen zu, wenn sie mit DOW aufgezogen wurden. Dies ist der erste Bericht über dieses Peptid bei einem Kopffüßer. Laut einer BLAST-Suche wurden nur acht Sequenzen hinterlegt; Alle hatten Aminosäuresequenzen, die für mehrere Peptide kodierten, und die Sequenzen reifer Peptide waren polymorph mit GSWN oder GSWD, was auch bei Tintenfischen der Fall ist (Abb. 5B und 7). Die eine kodierende Sequenz kodierte sechs reife Peptide, während die anderen vier bis fünf Peptide kodierten, und die Peptidase-Exzisionsstellen blieben ebenfalls konserviert (Abb. 7). Wir beabsichtigen, das Vorhandensein von D-Typ-Aminosäureresten in diesem Peptid und seine Bioaktivität im Detail zu untersuchen.

Logodarstellung eines mit Achatin verwandten Neuropeptids. Logo-Darstellung von Achatin-verwandten Neuropeptiden basierend auf einem Sequenz-Alignment von webBLASTP-Homologen zu Todarode-Achatin-verwandten. Rot unterstrichen, mutmaßliches reifes Peptid; blaues Rechteck, mutmaßliche Peptidase-Spaltstellen.

Elevenin wurde als eine cDNA-Sequenz identifiziert, die einen Neuropeptid-Vorläufer aus dem L11-Neuron in den Bauchganglien des Kalifornischen Seehasen Aplysia californica kodiert24. Danach führte der Abbau von Elevenin durch RNA-Interferenz zu einer starken Melanisierung der Kutikula bei der braunen Gartenzikade Nilaparvata lugens25. Darüber hinaus rettete die Verabreichung des synthetischen Elevenin-Peptids den Phänotyp der Körperfarbe bei mit Elevenin-dsRNAi behandelten Personen und unterdrückte die Melanisierung schwarzer Insekten, die unter natürlichen Bedingungen gezüchtet wurden25. Ein Elevenin-ähnliches Peptid (CKVFIFHPKCRGVAA), das im Gehirn von Tintenfischen gefunden wird, könnte am Melaninstoffwechsel von Tintenfischen beteiligt sein. Dieses Peptid kodiert ein einzelnes reifes Peptid wie Oegopressin 1 und 2 (Abb. 5). Laut einer BLAST-Suche wurden 12 Sequenzen hinterlegt. Es gab eine Variation in der Sequenzlänge des reifen Peptids, aber die Konsensus-Cysteinreste waren gut konserviert (Abb. 8A, B).

Logodarstellung (A) und Sequenzausrichtung (B) von Elevenin-ähnlichen Neuropeptiden. (A) Logo-Darstellung von Elevenin-ähnlichen Neuropeptiden basierend auf einer Sequenzausrichtung von webBLASTP-Homologen zu Todarode Elevenin-ähnlichen. Rot unterstrichen, mutmaßliches reifes Peptid; blaues Rechteck, mutmaßliche Peptidase-Spaltstellen. (B) Sequenzausrichtung von Elevenin-ähnlichen reifen Peptiden von Wirbellosen.

Es ist bekannt, dass die Vasopressin/Oxytocin-Superfamilie den Mineralstoffwechsel reguliert26,27,28. Mehrere Peptide sind bei Wirbellosen auch an der Regulierung des Lipidstoffwechsels beteiligt29,30. Daher ist es wahrscheinlich, dass diese Peptide, die nach der Aufzucht mit DOW im Gehirn des Tintenfischs hochreguliert werden, eine physiologische Aktivität im Tintenfisch haben und sowohl den Mineralstoff- als auch den Lipidstoffwechsel regulieren. Bei Säugetieren spielt Mg2+ in DOW eine wichtige Rolle im Lipidstoffwechsel1,5. Bei Säugetieren können Neuropeptide des Gehirns auch an der Regulierung des Lipidstoffwechsels durch DOW beteiligt sein. Die Analyse der Wirkung dieser Peptide bei Tintenfischen könnte auch zu den Auswirkungen von DOW auf den Lipidstoffwechsel bei Säugetieren beitragen. Daher möchten wir die Auswirkungen dieser Peptide auf Tintenfische untersuchen, um ihre physiologischen Auswirkungen auf Tintenfische zu bestimmen und einen Beitrag zur Tintenfisch-Aquakultur zu leisten.

Ein wichtiges Thema, das wir angesprochen haben, war der Mechanismus, der DOW zugrunde liegt und die physiologischen Eigenschaften des Tintenfischs beeinflusst. Wir haben herausgefunden, dass DOW den Stress bei Meeresfischen reduziert, die unter Bedingungen hoher Dichte gezüchtet wurden9. Darüber hinaus haben wir Kynurenin, einen Bestandteil von DOW, als verantwortlichen Faktor für die stressreduzierende Wirkung von DOW identifiziert. Basierend auf den Ergebnissen gehen wir davon aus, dass unbekannte Komponenten, die in DOW vorhanden sind, für die durch DOW induzierten physiologischen Merkmalsänderungen des Tintenfischs verantwortlich sind.

DOW hat erhebliche physiologische Auswirkungen auf T. pacificus. Diejenigen, die mit DOW aufgezogen wurden, hatten im Vergleich zu denen, die mit SSW aufgezogen wurden, einen geringeren Gewichtsverlust. Somit könnten die Ergebnisse unserer Forschung mit DOW auf Techniken zur Tintenfischaufzucht angewendet werden.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der ARRIVE-Richtlinie31 für die Berichterstattung über In-vivo-Experimente mit Versuchstieren durchgeführt. Alle Versuchsprotokolle in dieser Studie wurden vom Tierschutzausschuss der Universität Kanazawa genehmigt. Alle Experimente wurden so durchgeführt, dass Schmerzen und Beschwerden minimiert wurden.

Ein japanischer Tintenfisch T. pacificus (n = 19, 148,1 ± 5,4 g) wurde in der Bucht von Toyama von einem Fischer gesammelt. Um die Tintenfischart zu bestätigen, wurde das COI-Gen (TRINITY_DN15407_c0_g2_i1) aus den gesammelten Tintenfischen kloniert. Anschließend wurde die Sequenz des klonierten Gens bestimmt, um eine BLAST-Suche durchzuführen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die bestimmte Sequenz mit der Sequenz des COI-Gens von T. pacificus identisch war (Abb. S3). Nach der Akklimatisierung, die einen Tag lang in SSW bei 15–16 °C für 6 Stunden gehalten wurde, wurden diese Tintenfische in den vorliegenden Experimenten verwendet.

Die Tintenfische wurden in zwei Gruppen eingeteilt (SSW: n = 9; DOW: n = 10) und 36 Stunden lang bei 15–16 ° C mit SSW oder DOW gehalten. Diese Tintenfische wurden nicht mit Ködern gefüttert. Nach 36-stündiger Aufzucht mit SSW oder DOW wurden diese mit kaltem Meerwasser betäubt und mit einer Spritze wurde Hämolymphe aus ihrem Kiemenherz entnommen. Die gesammelte Hämolymphe wurde in ein 1,5-ml-Röhrchen gegeben. Anschließend wurde das Röhrchen 5 Minuten lang bei 5200 × g zentrifugiert. Die abgetrennte Hämolymphe wurde sofort eingefroren und bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C aufbewahrt. Nach der Hämolymphenentnahme wurde jeder Tintenfisch seziert. Das Gehirn über der Speiseröhre wurde extrahiert, in RNAlater (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) gegeben und bei –80 ° C gelagert.

Zusätzlich wurden Veränderungen des Körpergewichts vor und nach der Aufzucht untersucht. Da diese Art nicht einzeln gezüchtet werden kann, wurden Veränderungen im durchschnittlichen Körpergewicht der SSW- und DOW-Gruppen stattdessen anhand ihres individuellen Körpergewichts berechnet.

Hämolymphproben wurden an einen kommerziellen Anbieter (Oriental Yeast Co., Ltd., Tokio, Japan) geschickt und Na+, Cl− und K+ wurden mit einer Ionenelektrodenmethode unter Verwendung eines automatischen Analysegeräts Hitachi 7180 (Hitachi High Technologies Corporation, Tokio) gemessen , Japan). Die Mg2+-, Ca2+- und iP-Spiegel in der Hämolymphe (mg/dL) wurden mithilfe von Assay-Kits bestimmt (Mg2+: Mg·N, FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan; Ca2+: Ca II, Shino-Test Corporation, Tokio, Japan; iP : IP-II, Kyowa Medex Co., Ltd., Tokio, Japan). TP, ALB, GLU, T-CHO, F-CHO, E-CHO, Triglycerid, AST-Aktivität, ALT-Aktivität und CK in der Hämolymphe wurden mit mehreren Kits (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) gemessen.

Gesamt-RNAs wurden mit einem Kit (RNeasy Plant Mini Kit, Qiagen GmbH, Hidden, Deutschland) isoliert. Genomische DNA wurde mit einem RNase-Free DNase Set (Qiagen) entfernt. Eine komplementäre DNA-Bibliothek wurde mit einem 150-bp-Paired-End-Modul unter Verwendung von Illumina NovaSeq 6000 (Illumina, San Diego, CA, USA) erstellt und sequenziert. Rohsequenzablesungen wurden bei der DNA Data Bank of Japan (DDBJ) unter der DDBJ Sequence Read Archive (DRA)-Zugangsnummer hinterlegt. DRA015361. Adapter und Lesevorgänge mit geringer Qualität wurden mit fastp v0.23.2 (Standardeinstellung 32) entfernt. Anschließend wurden Unigene mit dem Trinity-Assemblerprogramm v2.8.533 erhalten. Nur Contigs mit einem Transkript pro Million von mehr als 1,0 wurden mit dem Trinity-Dienstprogramm v2.14.0 gefiltert und für die anschließende Analyse verwendet. Für die Kartierungsanalyse wurde Kallisto verwendet34. Die statistische Analyse für unterschiedlich exprimierte Gene wurde mit EdgeR in den Trinity-Dienstprogrammen durchgeführt. Transdecoder v5.5.0 wurde zur Schätzung genkodierender Regionen verwendet (https://github.com/TransDecoder/TransDecoder) und eggNOGmapper v2.1.9 wurde für die funktionale Annotation von Aminosäuresequenzdaten verwendet35,36.

Homologe Sequenzen von Neuropeptidsequenzen (Oegopressin 1 und Oegopressin 2, Achatin-verwandtes Peptid und Elfin-ähnliches Peptid) wurden von NCBI webBLAST (blastp) geschätzt (Stand: 27. November 2022). Ausrichtungen von Aminosäuresequenzen wurden mit MAFFT auf EMBL-EBI37 geschätzt. Mview auf EMBL-EBI wurde verwendet, um die Ergebnisse des MAFFT-Alignments neu zu formatieren. Sequenzlogos wurden mit Weblogo3 (https://weblogo. threeplusone.com/) generiert, um die Sequenzkonservierung an jeder Sequenzposition 38, 39 zu zeigen.

Alle Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardfehler ausgedrückt. Die statistische Signifikanz zwischen der Kontroll- und der Versuchsgruppe wurde mithilfe eines unabhängigen Stichproben-T-Tests bewertet. Das gewählte Signifikanzniveau war p < 0,05.

Die Rohsequenzablesungen wurden bei der DNA Data Bank of Japan (DDBJ) unter der DDBJ Sequence Read Archive (DRA)-Zugangsnummer hinterlegt. DRA015361 (https://ddbj.nig.ac.jp/resource/sra-submission/DRA015361).

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Diese Studie wurde teilweise durch Zuschüsse an Nobuo Suzuki (Grant-in-Aid for Scientific Research [C] Nr. 20K06718 von JSPS), Adaptable and Seamless Technology Transfer Program through Target-driven R&D Nr. JPMJTM20NC von JST und der Nippon Foundation unterstützt ) und an Hajime Matsubara (Grant-in-Aid for Scientific Research [C] Nr. 21K05725 von JSPS). Diese Arbeit wurde teilweise durch das kooperative Forschungsprogramm des Instituts für Natur- und Umwelttechnologie der Universität Kanazawa, Accept, unterstützt. Nr. 22009, 22015, 22017, 22040 und 22044, von der Salt Science Research Foundation (Nr. 2209) und vom National University Management Reform Promotion Project (MEXT, Japan).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Kaito Hatano und Masa-Aki Yoshida.

Noto Marine Laboratory, Institut für Natur- und Umwelttechnologie, Universität Kanazawa, Ogi, Noto-cho, Ishikawa, 927-0553, Japan

Kaito Hatano, Yoichiro Kitani, Shouzo Ogiso, Yukina Watabe, Toshio Sekiguchi, Kenji Toyota und Nobuo Suzuki

Abteilung für Meeresbiologie, Bildungs- und Forschungszentrum für biologische Ressourcen, Fakultät für Lebens- und Umweltwissenschaften, Shimane-Universität, Oki, Shimane, 685-0024, Japan

Masa-Aki Yoshida

Abteilung für klinische Technik, Fakultät für Gesundheitswissenschaften und Abteilung für Gesundheitswissenschaften, Graduiertenschule für nachhaltige Systemwissenschaft, Komatsu-Universität, Komatsu, Ishikawa, 923-0961, Japan

Jun Hirayama

Fachbereich Biologie, College of Liberal Arts and Sciences, Tokyo Medical and Dental University, Ichikawa, Chiba, 272-0827, Japan

Atsuhiko Hattori

Life Science Research Center, Universität Toyama, Sugitani, Toyama, 930-0194, Japan

Yoshiaki Tabuchi

Institut für Noto-Satoumi-Bildung und -Studien, Ogi, Noto-cho, Ishikawa, 927-0553, Japan

Makoto Urata und Kyoko Matsumoto

School of Science, Akademische Versammlung, Universität Toyama, Gofuku, Toyama, 930-8555, Japan

Akihiro Sakatoku

Abteilung für Zoologie, DDU Gorakhpur University, Gorakhpur, 273-009, Indien

Ajay K. Srivastav

Noto-Zentrum für Fischereiwissenschaft und -technologie, Universität Kanazawa, Ossaka, Noto-cho, Ishikawa, 927-0552, Japan

Hajime Matsubara

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Alle Autoren haben zur Konzeption und Gestaltung der Studie beigetragen. Materialvorbereitung, Datenerfassung, Analyse und Diskussion wurden von KH, MAY, YK, JH, AH, SO, YW, TS, YT, MU, KM, AS, AKS, KT, HM und NS durchgeführt. Der erste Entwurf des Das Manuskript wurde von NS, MAY, HM und KH verfasst und alle Autoren kommentierten die vorherigen Versionen. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Nobuo Suzuki.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hatano, K., Yoshida, MA., Hirayama, J. et al. Tiefseewasser verändert den Cholesterin- und Mineralstoffwechsel des Tintenfischs Todarodes pacificus und unterdrückt seinen Gewichtsverlust. Sci Rep 13, 7591 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34443-x

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Eingegangen: 12. Januar 2023

Angenommen: 30. April 2023

Veröffentlicht: 10. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34443-x

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