Analyse des Rhodopsin-G-Proteins

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 8243 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Schistosomiasis ist eine medizinisch bedeutsame Erkrankung, die durch Helminthenparasiten der Gattung Schistosoma verursacht wird. Der Lebenszyklus von Schistosomen erfordert chemisch vermittelte Wechselwirkungen mit einem Zwischenwirt (Wasserschnecke) und einem Endwirt (Mensch). Um die Parasitenentwicklung im Schneckenstadium zu blockieren, ist ein besseres Verständnis der Wechselwirkungen zwischen dem Schneckenwirt und der im Wasser vorkommenden freilebenden Form Schistosoma (Miracidium) erforderlich. Innovationen in der Schneckengenomik und der chemischen Kommunikation im Wasser bieten eine ideale Gelegenheit, die Koevolution von Schnecken und Parasiten auf molekularer Ebene zu untersuchen. Rhodopsin-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind von besonderem Interesse für die Untersuchung, wie Trematodenparasiten zu ihren Schneckenwirten navigieren. Die potenzielle Rolle von GPCRs in Parasiten macht sie zu potenziellen Zielen für neue Antihelminthika, die die Zwischenstadien des Wirtslebenszyklus stören und so nachfolgende Infektionen beim Menschen verhindern. Mithilfe eines genomisch-bioinformatischen Ansatzes wurden GPCR-Orthologe zwischen der Schnecke Biomphalaria glabrata und Miracidia ihres obligaten Parasiten Schistosoma mansoni identifiziert. Wir zeigen, dass 8 S. mansoni-Rhodopsin-GPCRs, die im Miracidialstadium exprimiert werden, eine allgemeine Aminosäureähnlichkeit mit 8 verschiedenen B. glabrata-Rhodopsin-GPCRs aufweisen, insbesondere innerhalb von Transmembrandomänen, was auf konservierte Strukturmerkmale schließen lässt. Zu diesen GPCRs gehören ein Orphan-Peptid-Rezeptor sowie mehrere mit starken Sequenzhomologien zu rhabdomerischen Opsinrezeptoren, ein Serotoninrezeptor, ein Sulfakinin (SK)-Rezeptor, ein Allatostatin-A (Buccalin)-Rezeptor und ein FMRFamid-Rezeptor. Buccalin- und FMRFa-Peptide wurden in durch B. glabrata konditioniertem Wasser identifiziert, und wir zeigen, dass synthetisches Buccalin und FMRFa bei S. mansoni miracidia signifikante Richtungswechsel- und Umkehrreaktionen stimulieren können. Orthologe GPCRs wurden in S. mansoni miracidia und B. glabrata identifiziert. Diese GPCRs können ähnliche Liganden erkennen, einschließlich aus Schnecken stammender Geruchsstoffe, die das Auffinden von Wunderwirten erleichtern könnten. Diese Ergebnisse legen den Grundstein für zukünftige Forschungen zur Aufklärung der Mechanismen, durch die GPCRs die Wirtsfindung vermitteln, was zur möglichen Entwicklung neuartiger Anti-Schistosomen-Interventionen führen kann.

Metazoische Blutwürmer der Gattung Schistosoma sind die primären ätiologischen Erreger der Bilharziose beim Menschen, einer in 74 Ländern endemischen Krankheit, von der weltweit über 200 Millionen Menschen betroffen sind1. Weltweit sterben jährlich bis zu 200.000 Menschen direkt oder indirekt an Bilharziose2 und schätzungsweise 600 Millionen Menschen leben in Endemiegebieten3. Schistosomen haben einen komplexen diözischen Lebenszyklus, der ungeschlechtlich vermehrte Larven in einem Mollusken-Zwischenwirt und sexuell fortpflanzungsfähige erwachsene Würmer im Säugetier-Endwirt umfasst. Im Wasser schlüpfen Schistosoma mansoni-Eier zu frei lebenden, mobilen Miracidien, die einen kompatiblen Schneckenwirt, Biomphalaria glabrata4, suchen und infizieren müssen. Nach der Infektion kann sich ein einzelnes Miracidium ungeschlechtlich über Mutter- und Tochter-Sporozysten in mehrere tausend Cercarien vermehren, die sich bei ihrer Freisetzung jeweils zu einem erwachsenen Wurm im menschlichen Wirt entwickeln können. Die komplexen physiologischen und morphologischen Veränderungen, die mit dem Lebenszyklus von Schistosoma einhergehen, bedeuten, dass die anthropogene Kontrolle der Übertragung auf mehrere Lebenszyklusstadien gerichtet sein könnte. Gegenwärtig werden die erwachsenen Würmer in der Regel durch die Behandlung infizierter Menschen mit dem Medikament Praziquantel5 bekämpft. Dennoch bleibt die Krankheit in Entwicklungsländern eine ständige Bedrohung und die Weltgesundheitsorganisation hat anerkannt, dass weitere Forschung im Stadium der Schneckeninfektion erforderlich ist6. Alternative Methoden zur Beeinträchtigung des Lebenszyklus von Schistosomen könnten beispielsweise die Anwendung von Anthelminthika umfassen, die auf das Suchverhalten des Wirts nach Miracidien oder Cercarien abzielen7,8.

Schistosomen-Miracidien haben eine eingeschränkte Sicht und nur eine begrenzte Zeit (12–16 Stunden), um eine geeignete Wirtsschnecke zu finden9. Die Identifizierung des Wirts beinhaltet eine Reihe von Verhaltensreaktionen, die die Lokalisierung des Wirts fördern und dadurch die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Infektion erhöhen10,11. Die gemeinsame Lebensumgebung mit dem Zwischenwirt macht das Wunderstadium zu einem idealen Zeitpunkt, um den Lebenszyklus des Parasiten zu unterbrechen, und stellt ein Zielfenster für die Beurteilung der molekularen Komponenten dar, die für die Wirtsfindung erforderlich sind. Es treten zwei Hauptverhaltensreaktionen auf: eine anfängliche Ausbreitungs- und Richtungsphase, die durch die Vermittlung von Photorezeptoren beeinflusst wird, und eine sekundäre Such- und Kreisphase (Chemokinese), die olfaktorisch vermittelt wird7,12,13,14. Bisher liegen nur wenige Informationen über die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen vor, die den olfaktorisch vermittelten Wirtsnachweis durch Schistosomen-Miracidien bestimmen, obwohl kürzlich aus B. glabrata ein Peptid entdeckt wurde, das Verhaltensänderungen bei Miracidia hervorruft15.

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) gelten als chemosensorische Rezeptoren bei Eumetazoen16 und sind ein vielversprechender Forschungsschwerpunkt für das Verständnis der Wirtsfindung von Parasiten. GPCRs und nachgeschaltete biochemische Wege werden häufig als selektive pharmakologische Ziele für die Unterbrechung des Lebenszyklus von Parasiten verwendet17,18 und können daher wirksame Ziele für die Manipulation durch Wundermittel sein. Auf molekularer Ebene gibt es einige Berichte über die Biologie des S. mansoni-Rezeptors und die Signaltransduktionswege, beispielsweise die Entdeckung einer Reihe genomkodierter sensorischer Proteine19,20. Dazu gehören GPCRs21, die mit chemischen Liganden interagieren können, ein Konzept, das durch proteomische und funktionelle Expressionsanalysen gestützt wird, die GPCRs in der Miracidia- und adulten Tegumentalmatrix von Schistosomen identifizierten11,22,23. Die Untersuchung des S. mansoni-Genoms ergab zahlreiche GPCR-Sequenzen vom Rhodopsin-Typ unter Verwendung einer Kombination von drei bioinformatischen Algorithmen, darunter Phobius, HMMerSearch und Pfam-Scan24,25. Zu den in den Miracidien exprimierten Opsinrezeptoren gehörten zwei Opsinrezeptoren, die das photokinetische Verhalten von Miracidien untermauern könnten26,27.

Neue Informationen zeigen, dass die enge Verbindung der Schnecke und ihres obligaten Schistosomenparasiten zur Bildung ihrer jeweiligen Genome beigetragen hat. Die genetische Variabilität des Schneckenwirts und nicht die des menschlichen Wirts könnte ein wichtigerer Faktor bei der Beeinflussung der Variabilität der Lebensgeschichtemerkmale in Schistosomen sein28,29,30. Beispielsweise wurde festgestellt, dass das Vorhandensein homologer Mucinproteine zwischen der Schnecke und verschiedenen S. mansoni-Stämmen Schlüsselelemente für die Kompatibilität von Schneckenwirt und Parasit sein können31. Dies steht im Einklang mit der Entdeckung einer signifikanten Homologie der nicht-kodierenden 5‘- und 3‘-Regionen nicht langer terminaler Wiederholungs-Retrotransposon-Nimbus-Sequenzen; Diese transponierbaren Klasse-I-Elemente kopieren sich und fügen sich an verschiedenen genomischen Stellen im Wirt und Parasiten ein, was auf eine mögliche horizontale Übertragung von Wirtssequenzen in den Parasiten hindeutet32,33.

In dieser Studie haben wir Rhodopsin-ähnliche GPCRs von S. mansoni miracidia identifiziert, die eine signifikante Sequenzidentität mit Rhodopsin-ähnlichen GPCRs in B. glabrata aufweisen. Dieses neue Wissen führte zu Peptidverhaltens-Bioassays an S. mansoni miracidia, die zeigten, dass FMRFa- und Buccalin-Peptide Verhaltensweisen hervorrufen können, die mit der Wirtsfindung übereinstimmen.

Die Durchführung und Verfahren im Zusammenhang mit Tierversuchen wurden von der Tierethikkommission des QIMR Berghofer Medical Research Institute (Projektnummer P242) genehmigt. Diese Studie wurde gemäß den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

Lebern wurden von ARC-Swiss-Mäusen gewonnen, die mit S. mansoni (Puerto-Rica-Stamm) infiziert waren, und zwar unter Bedingungen, die vom australischen Ministerium für Land-, Fischerei- und Forstwirtschaft (DAFF) festgelegt wurden. Mäuse wurden mit CO2-Gas eingeschläfert und ihre Lebern wurden mit gekühltem PBS durchströmt. Eier von S. mansoni wurden während der Perfusion von Mäusen gesammelt. Vier infizierte Mäuseleber wurden mit Skalpellklingen in Scheiben geschnitten und in 50 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu einer glatten Konsistenz vermischt. Ein zweitägiges Protokoll wurde verwendet, um relativ saubere Schistosomeneier und Miracidia zu erhalten34. Kurz gesagt, die Mischung aus Eiern und Mäuselebergewebe wurde mit Kollagenase B, Penicillin und Streptomycin bei 37 °C über Nacht inkubiert, gefolgt von einer Fraktionierung mit Percoll-Säulen (8 ml Percoll + 32 ml 0,25 M Saccharose in 50-ml-Röhrchen). Die Eipellets wurden zweimal mit PBS auf einer zweiten Percoll-Säule gewaschen (2,5 ml Percoll + 7,5 ml 0,25 M Saccharose in einem 15-ml-Röhrchen). Gereinigte Eier wurden in einen 200-ml-Schlupfmesszylinder überführt, der vollständig mit lichtblockierendem schwarzem Klebeband umwickelt war, wobei die oberen 4 cm von der Lippe entfernt blieben, wodurch ein Lichtgradient erzeugt wurde. Der Brutzylinder wurde mit pH-neutralem MilliQ-Wasser bis etwa 1,5 cm über dem mit Klebeband bedeckten Bereich aufgefüllt und hellem Licht bei 27 °C ausgesetzt. Die Eier wurden nach dem Schlüpfen 6 Stunden lang inkubiert und die obersten 10 ml Miracidia-haltiges Wasser wurden zur Miracidia-Isolierung gesammelt. Geschlüpfte Miracidien wurden durch 1-minütige Zentrifugation bei 8.000 × g und 4 ° C isoliert und zweimal mit Wasser gewaschen. Zur RNA-Isolierung wurden Miracidia 6 Stunden nach dem Schlüpfen gesammelt und bei -80 °C aufbewahrt. Die Gesamt-RNA wurde aus S. mansoni miracidia (6 Stunden nach dem Schlüpfen in dreifacher Ausfertigung) unter Verwendung von TRIzol-Reagenz gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers (Invitrogen, USA) isoliert. Die RNA-Menge und -Qualität wurde durch UV-Spektrophotometrie (NanoDrop ND-1000) bewertet Die RNA wurde an NovoGene (Hongkong) für die RNA-Sequenzierung der Illumina 2500-Plattform der nächsten Generation gesendet. Die Rohsequenzdaten wurden beim GenBank NCBI unter der Zugangsnummer SRR17224866 hinterlegt. Die De-novo-Transkriptomassemblierung der Rohsequenzdaten von S. mansoni miracidia wurde mit Trinity durchgeführt, wie zuvor beschrieben35,36 und Contigs wurden mit Transdecoder35 in Proteinsequenzen übersetzt. Die Genexpressionsniveaus von S. mansoni miracida wurden berechnet, indem Rohsequenzdaten mit dem S. mansoni-Referenzgenom verglichen wurden, das von WormBase Parasite (https://parasite.wormbase.org/Schistosoma_mansoni_prjea36577/Info/Index/) unter Verwendung von CLC Genomic Workbench stammt Standardparameter37.

Die Pipeline zur Identifizierung orthologer GPCRs, die von B. glabrata und S. mansoni gemeinsam genutzt werden, ist in Abb. 1 dargestellt. Für B. glabrata wurden Daten zu GPCRs und ihren Expressionsniveaus in verschiedenen Geweben aus einer früheren Studie abgerufen6. Mit S. mansoni wurden Transkriptom-abgeleitete Proteinsequenzen nach Pfam-basierten Profilen und TM-Domänen durchsucht, um Rezeptoren zu identifizieren, die zur Rhodopsin-GPCR-Familie gehören. Konkret umfasste dies zwei bioinformatische Tools zur Vorhersage von TM-Domänen für alle Proteine, einschließlich TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) und Phobius (http://phobius.sbc.su). se/). Da TM-Domänen geeignete Marker für GPCRs sind, haben wir uns nur auf Sequenzen mit 7-TM-Domänen konzentriert. Als nächstes haben wir eine Pfam-basierte Profilsuche mit HMMerSearch (http://www.hmmer.wustl.edu/) durchgeführt. Proteine, die mutmaßliche GPCR-Domänen vom Rhodopsin-Typ enthielten, wurden systematisch durch Profilsuchvorgänge mit versteckten Markov-Modellen unter Verwendung des HMMer-Pakets (http://www.hmmer.wustl.edu/) und des PFAM-Modells PF00001 (7tm_1) identifiziert.

Arbeitsablauf zur Identifizierung gemeinsamer GPCRs, die aus dem Genom und Transkriptom von B. glabrata von S. mansoni miracidia gewonnen wurden.

Mutmaßliche GPCRs, die in S. mansoni miracidia identifiziert wurden, wurden verwendet, um die GPCR-Datenbank von B. glabrata abzufragen (unter Verwendung von tBLASTp). Diese Sequenzen mit E-Werten <1,0E-20 wurden abgerufen und mithilfe von TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) auf das Vorhandensein wiederkehrender Transmembranmotive untersucht. Für die weitere Analyse wurden diejenigen ausgewählt, die 7 Transmembrandomänen (TM) enthielten. Mehrere Sequenz-Alignments wurden mit der MEGA-Software (Molecular Evolutionary Genetics Analysis), Version 6.038, mit dem MUSCLE39-Algorithmus erstellt. Phylogenetische Bäume wurden unter Verwendung der Neighbor-Joining-Methode mit 1000 Bootstrap-Replikaten zur Knotenunterstützung erstellt. Die Kartierung der Genontologie und die funktionale Annotation wurden mithilfe von OmicsBox (BioBam)40 angewendet. Der endgültige phylogenetische Baum und die Heatmap wurden mit iTOL v541 geändert.

Synthetisches FMRFa (FMRF-NH2), Bukkalin (RLDRFGFAGQL-NH2) und SK (NYGDYGIGGGRFGR) wurden von China Peptides (Shanghai, China) bereitgestellt (Reinheit ≥ 95 %). Serotonin (5-Hydroxytryptamin/5-HT) wurde von Sigma (Burlington, USA) bereitgestellt (Reinheit ≥ 98 %). Stammlösungen von FMRFa (100 μM), Bukkalin (100 μM), SK (100 μM) und 5-HT (5 nM) wurden durch Auflösen in MilliQ-Wasser hergestellt. MilliQ-Wasser wurde in Bioassays als Negativkontrolle verwendet.

Die Isolierung von S. mansoni miracidia etwa 2 Stunden nach dem Schlüpfen erfolgte wie in Wang et al.21 beschrieben. Für jeden Test wurden 30 ± 5 aktiv schwimmende Miracidien in pH-neutralem MilliQ-Wasser (insgesamt ~ 4 ml) mit einer Pipette gleichmäßig im zentralen Bereich einer Petrischale (100 mm × 15 mm) mit 4 ml MilliQ-Wasser verteilt. Der Schwimmbereich der Miracidien wurde vor der Analyse unter dem Mikroskop abgedeckt, um eine Lichtverzerrung zu verhindern. Für Tests wurden 2 µl Testlösung in den zentralen Bereich der Petrischale gegeben. Während des Testzeitraums von 1 Minute wurde eine gewisse Diffusion jedes Moleküls erwartet. Die Tests wurden auch bei 10-fachen und 100-fachen Reihenverdünnungen getestet. Zur Aufzeichnung der Miracidia-Bewegung vor und nach der Zugabe der Testlösungen wurde ein inverses zusammengesetztes Mikroskop mit Videofunktion (OLYMPUS CKX41) verwendet, das mit einer digitalen OLMPUS DPI-Mikroskopkamera DP22 (2,8-Megapixel-Bild mit einer Rate von 15 Bildern pro Sekunde) ausgestattet war gebraucht. Das Sichtfeld (FOV) der realen Kamera betrug 2.500 × 1.875 mm. Die Miracidia-Bewegung wurde 1 Minute lang vor und nach der Zugabe jeder Testlösung aufgezeichnet und die aufgenommenen Videos wurden mit Tracker 4.87 verarbeitet.

Die Flugbahnen von Miracidia wurden manuell vom Eintritt in das Sichtfeld bis zum Austritt verfolgt, bzw. bis zu 1 Minute für diejenigen, die innerhalb des Sichtfelds blieben. Es wurden nur Miracidien einbezogen, die länger als die Länge der kurzen Kante (7,5 cm) des Sichtfelds geschwommen waren, vor und nach der Zugabe der Lösung (Datei S1); diejenigen, die dies nicht taten, wurden als statistisch bedeutungslos angesehen. Die durchschnittliche Verweildauer von Miracidia im Sichtfeld wurde als weiteres wichtiges Verhaltensmerkmal betrachtet und statistisch verglichen. Für die Miracidien, die nach Zugabe der Lösung länger als 1 Minute verblieben, wurde die Zeitdauer innerhalb dieser 1 Minute zum Vergleich herangezogen und der mittlere Beschleunigungswert berechnet. Beschleunigung und Geschwindigkeit von Miracidium wurden auf der Grundlage von Flugbahnen berechnet, wobei die Einheiten in cm s-2 und cm/s umgerechnet wurden. Zur Berechnung der P-Werte wurde ein gepaarter zweiseitiger t-Test verwendet. Darüber hinaus wurde, sofern anwendbar, eine Zwei-Wege-ANOVA-Analyse42 durchgeführt, um die Signifikanz der Änderungen (Beschleunigung, Geschwindigkeit und Zeit) zwischen den Testlösungen und der Negativkontrolle zu bewerten.

Um festzustellen, ob Kandidatenpeptidliganden in mit B. glabrata konditioniertem Wasser vorhanden waren, wurden zwei Ansätze verfolgt. Zunächst wurden Massenspektrometriedaten, die aus einer vorherigen Analyse von B. glabrata-konditioniertem Wasser43 stammten, unter Verwendung von Zielvorläuferproteinen durchsucht.

Zweitens wurde eine Antikörper-vermittelte Dot-Blot-Analyse unter Verwendung von mit B. glabrata konditionierten Wasserextrakten durchgeführt. B. glabrata wurden mit pH-neutralem MilliQ-Wasser gewaschen und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (RT) in Bechergläser mit 20 ml Wasser gegeben. Schnecken wurden entfernt, konditioniertes Wasser von 20 Schnecken (in verschiedenen Aquarien) gesammelt und 20 ml Methanol in jedes Becherglas gegeben und gründlich gemischt. Das konditionierte Wasser wurde durch PVDF Millex-HV-Spritzenfiltereinheiten (0,45 µm) gefiltert, um Partikel und Mikroben zu entfernen. Das Filtrat wurde schockgefroren und lyophilisiert. Für Negativkontrollen wurde Wasser, das zuvor keinen Schnecken ausgesetzt war, auf ähnliche Weise verarbeitet. Wenn für den Dot-Bot-Assay erforderlich, wurden die Proben mit 200 μl MilliQ-Wasser rehydratisiert und 5 Minuten lang bei 12.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und 1:1 in MilliQ-Wasser verdünnt. Die Quantifizierung wurde mit einem NanoDrop 2000c UV-Vis-Spektrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, USA) bei A280 nm durchgeführt. B. glabrata-Extrakte mit 5 g\(\upmu\)/\(\upmu\)l, 500 ng/\(\upmu\)l und 50 ng/\(\upmu\)l wurden aufgetragen (2 μl). eine Nitrozellulosemembran (0,45 m\(\upmu\), BioRad, Hercules, US), die zuvor in 1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) eingeweicht und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur luftgetrocknet wurde. Die Membran wurde 1 Stunde lang in Blockierungspuffer (2 % (v/v) Magermilch in PBS) inkubiert und mit primärem Antikörper versetzt [1:500; Kaninchen-Anti-Buccalin44, Kaninchen-Anti-FMRFa (Genscript, Piscataway, USA), Ratten-Anti-5-HT (Sigma)] für 1 Stunde bei RT. Die Membranen wurden mit PBS-Tween20 (0,1 % (v/v)) gewaschen und 1 Stunde bei RT mit sekundärem Antikörper [1:5000; Anti-Kaninchen-Ig-IR 680 (LI-COR, Lincoln, USA) oder Anti-Ratten-Ig-IR 795 (LI-COR)]. Nach dem Waschen (3x, 5 Minuten) in PBST wurden die Blots mit einem Odyssey CLx, LI-COR-Gerät sichtbar gemacht.

Die transkriptomischen Rohsequenzdaten von S. mansoni miracidial wurden im GenBank NCBI unter der Zugangsnummer SRR17224866 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRR17224866) hinterlegt. Das Referenzgenom von S. mansoni ist bei WormBase Parasite (https://parasite.wormbase.org/Schistosoma_mansoni_prjea36577/Info/Index/) erhältlich. Der ursprüngliche B. glabrata-Proteindatensatz ist bei VectorBase verfügbar (https://vectorbase.org/vectorbase/app/downloads/Current_Release/BglabrataBB02/fasta/data/).

Insgesamt wurden 96 Proteine mit 7-TM-Domänen aus den vom S. mansoni-Transkriptom abgeleiteten Proteinmodellen basierend auf der TMHMM-Vorhersage extrahiert. Die Vorhersage von Phobius führte zur Identifizierung von 139 Proteinen mit 7-TM-Domänen. Die Pfam-Profilierung beider Vorhersagen führte zur Klassifizierung von 87 Proteinen (E-Wert < 0,0004) als Rezeptoren vom Rhodopsin-Typ. Die BLASTp-Analyse dieser GPCRs gegen alle B. glabrata-Rhodopsin-GPCRs zeigte signifikante Übereinstimmungen (E-Wert < 1,0E−20) für 8 GPCRs (Tabelle 1) mit einer Aminosäureidentität zwischen 26 und 48 % (Datei S2a). BLASTp-Suchen unter Verwendung aller orthologen GPCRs von S. mansoni und B. glabrata in der nicht-redundanten NCBI-Datenbank (nr) ergaben die besten Treffer für GPCRs, einschließlich 5-HT (Serotonin), Allatostatin-Typ A (AST-A), FMRFa, SK, Orexin Typ 2, Neuropeptid F, Orphan-Peptid und Opsin-ähnliche GPCRs (Tabelle 1, Abb. 2A und Datei S2b). In B. glabrata wurden alle GPCRs im ZNS exprimiert, während der verwaiste Rhodopsin-GPCR die weiteste Gewebeverteilung aufwies (Abb. 2B). In S. mansoni miracidia zeigte das Rhodpopsin-GPCR-Ortholog im Vergleich zu anderen Rezeptoren das höchste durchschnittliche Expressionsniveau (Abb. 2B).

Charakterisierung von GPCR-Orthologen, die B. glabrata und S. mansoni miracidia gemeinsam haben. (A) Phylogenetische Baumanalyse gemeinsamer GPCRs, wobei jeder B. glabrata-GPCR mit einem orthologen Rezeptor von S. mansoni Cluster bildet. Bootstrap-Werte unterstützen die Konfidenzniveaus von Kladen. (B) Heatmap, die die Expression gemeinsamer GPCR- (in TPM) kodierender Gene in S. mansoni miracidia 6 Stunden nach dem Schlüpfen und in verschiedenen B. glabrata-Geweben zeigt. Die Spalten stellen biologische Replikate von S. mansoni miracidia (1–3) und deren Mittelwert sowie Biomphalaria (Glabrata)-Gewebe dar.

Die Aufklärung von Interspezies-GPCR-Orthologen mit mutmaßlichen Liganden bot die Gelegenheit zu untersuchen, wie aus Schnecken stammende Biomoleküle S. mansoni miracidia beeinflussen. 5-HT ist ein gut etablierter eumetazoischer Neurotransmitter, während die B. glabrata-Neuropeptide FMRFa, Buccalin [in Mollusken als AST-A-Homolog erkannt45] und SK bereits zuvor in B. glabrata6,46 identifiziert und daher auf Bioaktivität getestet wurden Miracidien. Die Trajektorien der Miracidial-Bewegung vor und nach der Zugabe der FMRFa- und Bukkalin-Peptide (2 µl bei 100 µM) werden in Abb. 3A, B verglichen. Repräsentative Filme können in den Filmen S1 und S2 angesehen werden. Vor der Zugabe schwammen Miracidia im Allgemeinen auf einem direkten, linearen Weg über das Sichtfeld (Abb. 3A, B – Vorher). Nach der Anwendung zeigten Miracidia eine lokalisierte Bewegung innerhalb des Sichtfelds sowie ein verstärktes Kreisschwimmen (Abb. 3A, B – Nachher). Bei Anwendung von Bukkalin oder FMRFa-Peptiden schwammen Miracidia im FOV länger, mit Ausnahme von Bukkalin bei 10 µM (P-Wert = 0,2964) (Abb. 3C). Die Änderung der Beschleunigung war nach Zugabe von Bukkalin oder FMRFa (100 µM und 10 µM) signifikant (Abb. 3D). Peptide stimulierten ein Schwimmmuster, das sich um die Stelle der Peptide herum konzentrierte.

Miracidial-Verhaltenstest unter Verwendung von Bukkalin und FMRFa-Peptiden. (A) Repräsentative Trajektorien der Miracidial-Bewegung vor und nach der Zugabe der Buccalin-Lösung (100 µM) in die Mitte des Aufnahmebereichs. Jede Farbe repräsentiert ein nicht unterscheidbares Miracidium-Individuum. Ein repräsentatives Testvideo finden Sie im Film S1. (B) Repräsentative Flugbahnen der Miracidia-Bewegung vor und nach der Zugabe der FMRFa-Lösung (100 µM) in die Mitte des Bereichs. Jede Farbe repräsentiert ein nicht unterscheidbares Miracidium-Individuum. Ein repräsentatives Testvideo finden Sie im Film S2. (C) Diagramm der Zeitdauer, in der Miracidia in der Videozone verbleibt, und (D) mittlere Beschleunigungswerte vor und nach der Zugabe von Buccalin und FMRFa.

Im Gegensatz dazu war nach der Anwendung von 5-HT (5 nM; Film S3) die Zeit innerhalb des Sichtfelds unbedeutend, die Änderung der Beschleunigung jedoch signifikant (Datei S3). Peptide (100 µM) führten dazu, dass Miracidien länger in der Region blieben, in der das Peptid hinzugefügt wurde, es gab jedoch keine signifikante Änderung der Durchschnittsgeschwindigkeit, wie aus der Zwei-Wege-ANOVA-Analyse (Datei S4) hervorgeht. Auch bei der Zugabe des SK-Peptids in drei verschiedenen Konzentrationen (100 µM, 10 µM und 1 µM; Film S4) gab es keine signifikante Änderung der Zeit innerhalb des Sichtfelds oder der Durchschnittsgeschwindigkeit. Als Negativkontrolle wurde MilliQ-Wasser an S. mansomi miracidia getestet und es wurden keine Verhaltensänderungen beobachtet.

Der Buccalin-Vorläufer von B. glabrata enthält zahlreiche Buccalin-ähnliche Peptide (Abb. 4A). Die am stärksten konservierte Region in den Bukkalinen ist ein C-terminales FXGGIG, das nach der posttranslationalen Prozessierung zu einem amidierten Peptid wird. Dot-Blots, die an konditionierten Wasserextrakten von B. glabrata durchgeführt wurden, zeigten das Vorhandensein eines Buccalin-ähnlichen Peptids bei Extraktverdünnungen von 10 μg bis 0,1 μg (Abb. 4B). Der FMRFa-Vorläufer von B. glabrata enthält zahlreiche FMRFa-verwandte Peptide (FaRPs), darunter FMRFa, FLRFa und FIRFa (Abb. 4C). Die Analyse proteomischer Massenspektrometriedaten aus naivem B. glabrata-Schneckenwasser43 ergab 4 Peptidübereinstimmungen für den FMRFa-Vorläufer, allerdings nicht spezifisch innerhalb eines FaRPs. Dot-Blots, die an konditionierten Wasserextrakten von B. glabrata durchgeführt wurden, zeigten das Vorhandensein von Peptiden mit Ähnlichkeit zu FaRPs bei Extraktverdünnungen von 10 μg bis 0,1 μg (Abb. 4D).

Biomphalaria glabrata-Vorläufersequenz und Dot-Blot-Assay für Buccalin und FMRFa in mit B. glabrata konditioniertem Wasser. (A) Buccalin-Neuropeptid-Vorläufersequenz (B) Dot-Blot mit Anti-Buccalin auf mit B. glabrata konditionierten Wasserextrakten bei 10, 1 und 0,1 mg. (C) Buccalin-Neuropeptid-Vorläufersequenz. (D) Dot-Blot mit Anti-FMRFa auf mit B. glabrata konditionierten Wasserextrakten bei 10, 1 und 0,1 g\(\upmu\). -ve Control stellt nur gereinigten Wasserextrakt dar. Für Vorläufersequenzen: Gelb – Signalpeptid, Rot – mutmaßliche Spaltstellen, Grün – Amidierung, Grau – bioaktive Peptide, Rosa – MS-Peptid-Übereinstimmungen.

S. mansoni miracidia reagiert auf aus Schnecken stammende Biomoleküle43, obwohl die genaue Identität des/der aktiven Biomolekül(e) nicht klar definiert wurde. Eine Studie implizierte „Miracidien-anziehende Glykoproteine“, die im Schneckenschleim vorhanden sind12, während eine Silico-Analyse von B. glabrata-Schneckenproteinen in konditioniertem Wasser Wechselwirkungen von nicht charakterisierten S. mansoni-Proteinen mit B. glabrata-Proteinen vorhersagte43. Auch Peptide waren beteiligt, wobei ein aus Schnecken gewonnenes neues Peptid (mit der Bezeichnung P12) Veränderungen im Verhalten der S. mansoni miracidia stimulierte47.

Um Biomoleküle einzugrenzen, die möglicherweise am Zusammenspiel von Parasit und Wirt beteiligt sind, haben wir in dieser Studie Genressourcen sowohl von B. glabrata als auch von S. mansoni genutzt, um orthologe GPCRs zu identifizieren, die wahrscheinlich von jedem Organismus zum Nachweis ähnlicher Liganden verwendet werden. Wir berichteten, dass 8 GPCRs von S. mansoni miracidia eine signifikante Identität mit 8 GPCRs von B. glabrata aufweisen, nicht nur bei der GO-Kartierung, sondern auch innerhalb von Regionen, die mutmaßlichen TM-Domänen entsprechen. Dazu gehören GPCRs mit Ähnlichkeit zu Neuropeptid-GPCRs, die FMRFa-, AST-A/Buccalin- und Sulfakinin-Peptide binden. Wir schlagen vor, dass die Miracidial-Ortholog-GPCRs für die neuronale Signalübertragung verwendet werden können, wofür ein gemeinsamer Ligand erforderlich ist, und/oder zum Nachweis semiochemischer Biomoleküle im Wasser verwendet werden können. Letztere Erwartung wurde durch wundersame Verhaltensänderungen in Gegenwart von Schnecken-FMRFamid und AST-A/Buccalin-Peptiden bestätigt.

AST-A und sein Rezeptor wurden in verschiedenen Insekten48 charakterisiert, wo sie an mehreren Funktionen wie der Hemmung der Juvenilhormon-Biosynthese und der Reduzierung der Nahrungsaufnahme beteiligt sind.48 AST-A-ähnliche Neuropeptide wurden in Gastropoden und Muscheln, einschließlich Lottia, identifiziert gigantea, Theba pisana, Aplysia californica und Crassostrea gigas49,50,51,52. Buccalin, benannt nach seiner ersten Identifizierung im Musculus radula close in accessorius von A. californica53, ist an verschiedenen Aktivitäten bei Weichtieren beteiligt, beispielsweise an der Hemmung der Muskelkontraktion und der Regulierung der Nahrungsaufnahme und des Laichens53,54,55. Auch bei Gastropoden und Muscheln wurde der AST-A/Buccalin-Rezeptor durch In-silico-Analyse öffentlich verfügbarer Genomdatensätze, einschließlich des von B. glabrata56, identifiziert. In unserer Studie haben wir in S. mansoni ein AST-A/Bukkalin-Rezeptor-Ortholog identifiziert, obwohl es keine Berichte darüber gibt, dass S. mansoni ein Bukkalin-ähnliches Peptid aufweist. Tatsächlich zeigte eine umfassende Neuropeptiduntersuchung von 10 Platyhelminth-Arten, dass nur der freilebende Turbellarier Macrostomum lignano über ein Buccalin-ähnliches Peptid (npp-9-Gen; GAYSGFLG) verfügt57. Wir identifizierten ein Buccalin-ähnliches Peptid im konditionierten Wasser von B. glabrata. Obwohl das Vorhandensein von Neuropeptiden in Schleimsekreten nicht ausreichend untersucht wurde, haben wir zuvor Neuropeptide (einschließlich Buccalin) im Speicheldrüsenschleim der Landschnecke T. pisana identifiziert58,59.

Das FMRFa wurde erstmals in der Hartmuschel Mercenaria mercenaria entdeckt und es wird angenommen, dass es eine pleitrope Rolle in der Physiologie der Weichtiere spielt60,61,62,63. Umfangreiche Studien an der Süßwasserschnecke Helisoma zeigten, dass FMRFa und verwandte Peptide nicht nur im Nervensystem, sondern auch in den Speicheldrüsen dicht konzentriert sind64. Ein FMRFa-Rezeptor wurde im Herz- und Nervengewebe der Landschnecke Helix62,65 und in der Sehlappenmembran des Tintenfischs Loligo pelei66 identifiziert. Das Genom von S. mansoni enthält ein Gen, das einen FLP-Vorläufer (npp-13-Gen) kodiert, der verarbeitet werden kann, um zwei RFamid-Peptide (HFMPQRFa und YTRFVPQRFa) freizusetzen57. Ein synthetisches FLP (GNFFRFa), das aus nicht-schistosomalen Platyhelminth-Vorläufern gewonnen wird, stimuliert in vitro die Kontraktion der Muskelfasern von S. mansoni67. Basierend auf Sequenzähnlichkeit und einem Rezeptor-Kalziummobilisierungstest wurde auch über einen FLP-Rezeptor im turbellären Plattwurm Girardia tigrina berichtet68. Der Homologrezeptor in S. mansoni miracidia wurde in der aktuellen Studie aufgrund seiner Ähnlichkeit mit dem FMRFa-Rezeptor von B. glabrata untersucht. Unsere Verhaltenstests zeigten auch, dass aus Schnecken stammendes FMRFa von S. mansoni miracidia erkannt werden kann, da sie deutlich länger im Sichtfeld bleiben und die Beschleunigung von Miracidia zunimmt, was durch das beobachtete Vorhandensein von FMRFa-Vorläuferpeptiden im konditionierten Wasser von B. glabrata unterstützt wird. Da S. mansoni jedoch das Potenzial hat, endogene FLPs zu erzeugen, können wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass das angewendete FMRFa endogene Effekte stimuliert, die zu den beobachteten wunderbaren Verhaltensänderungen führen.

Das Monoamin 5-HT spielt eine entscheidende Rolle bei der neuronalen Übertragung und wurde in allen Eumetazoen sehr gut dokumentiert, ebenso wie die Konservierung von 5-HT-GPCRs. Bei erwachsenen S. mansoni stimuliert 5-HT die motorische Aktivität69, während bei Miracidia ein immunfluoreszierender Ansatz 5-HT innerhalb der sensorischen Nerven lokalisierte70. Der 5-HT-GPCR wurde im Rahmen unserer GPCR-Orthologanalyse zwischen den Spezies identifiziert. Wir fanden jedoch heraus, dass 5-HT bei 5 mM das Wunderverhalten nicht veränderte, während die signifikante Änderung der Beschleunigung auf seine hohe Konzentration zurückzuführen war.

Sulfakinin ist ein sulfatiertes Neuropeptid, das vor allem für seine Funktion als Sättigungsfaktor (Nahrungsaufnahme) bekannt ist71. In-silico-Data-Mining zeigte, dass Mollusken-SK die C-terminale RF(W)-Amidsequenz aufweist, die Insekten-Sulfakininen gemeinsam ist, sowie das DY-Motiv, das sowohl Insekten-SKs als auch Wirbeltier-Cholecystokinin (CCK) gemeinsam haben72. Da CCKs von Wirbeltieren und SKs von Insekten ähnliche biologische Funktionen in Bezug auf die Sekretion von Verdauungsenzymen, das Sättigungsgefühl und die Kontraktion der glatten Muskulatur aufweisen73, ist es möglich, dass ihre Gegenstücke bei Mollusken ähnliche grundlegende biologische Aktivitäten beibehalten haben. Im Gegensatz dazu gibt es bei S. mansoni kein offensichtliches SK, was darauf hindeutet, dass der Parasit möglicherweise nur das SK von B. glabrata erkennt, entweder als sezerniertes Semiochemikali oder als Leitpeptid, sobald es in die Schnecke eindringt, um zum Hepatopankreas zu navigieren, wo es sich vermehrt74 . Unsere Verhaltenstests zeigten, dass SK das Wunderverhalten nicht veränderte (weder die Geschwindigkeit noch die Dauer unter dem FOV wurden beeinflusst) und es daher wahrscheinlicher ist, dass es bei S. mansoni als interner Reiz wirkt.

FMRFa- und Bukkalinpeptide könnten zu einem Cocktail aus Biomolekülen beitragen, der als wirksamer, artspezifischer Lockstoff eingesetzt werden könnte. Unsere seriellen Verdünnungstests deuteten auf eine anhaltende Bioaktivität sowohl für Buccalin- als auch für FMRFa-Peptide bei einer Konzentration von mindestens 1 µM hin. Wir berichten auch über ein Orphan-Peptid-GPCR-Orthologe in B. glabrata und S. mansoni miracida, was mit der Möglichkeit übereinstimmt, dass nicht charakterisierte artspezifische Peptide aufgrund ihres Vorkommens in vielen Geweben von B. glabrata dabei helfen könnten, Miracidia zum entsprechenden Schneckenwirt zu locken und sein hohes Expressionsniveau in S. mansoni miracidia.

Um die Übertragung zu minimieren und die Prävalenz von Bilharziose zu reduzieren, ist die Beeinträchtigung der Schnecken-Miracidium-Interaktion ein vielversprechender Plan zur Biokontrolle. Wir haben orthologe GPCRs charakterisiert, die B. glabrata und S. mansoni miracidia gemeinsam haben, wichtige Biomoleküle, die häufig für die chemosensorische Kommunikation verwendet werden. Die Buccalin- und FMRFa-GPCRs von B. glabrata stellten gute Ziele für Bioassays dar. Die Ergebnisse zeigten, dass Buccalin und FMRFa mirazidiale Verhaltensänderungen stimulierten, obwohl Homologe von Buccalin-ähnlichen Peptiden in S. mansoni nicht vorhanden sind. Diese GPCRs könnten neue Ziele für die Entwicklung von antihelminthischen Verbindungen darstellen, die in Seen angewendet werden sollen, und spezifisch die Erkennung von Schistosoma im Schneckenwirt beeinflussen. Für eine größere Speziesspezifität schlagen wir vor, dass die Deorphanisierung des orthologen Orphan-Peptids GPCR am vorteilhaftesten ist. Diese Erkenntnisse tragen weiter zu unserem Verständnis der chemosensorischen Interaktion zwischen Parasiten und ihren Wirten bei, insbesondere in aquatischen Umgebungen.

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Versteckte Markov-Modelle

Molekulare evolutionäre Genetikanalyse

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

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Referenzen herunterladen

Wir danken der University of the Sunshine Coast (USC), die einen internen Zuschuss zur Unterstützung dieser Arbeit bereitgestellt hat. Wir danken Catherine Mainwaring vom USC für ihre Hilfe. Diese Forschung wurde mit Unterstützung von Ressourcen der National Computational Infrastructure (NCI) durchgeführt, die von der australischen Regierung unterstützt wird. DPM ist Leadership Fellow des National Health and Medical Research Council und Senior Scientist am QIMR Berghofer. B. glabrata-Schnecken wurden vom NIAID Schistosomiasis Resource Center des Biomedical Research Institute (Rockville, MD) über den NIH-NIAID-Vertrag HHSN272201000005I zur Verteilung über BEI Resources bereitgestellt. Wir danken dem Biomphalaria-Genomkonsortium, das eine unschätzbare Ressource für die in dieser Studie erhaltenen Gensequenzen bereitgestellt hat.

Diese Arbeit wurde vom Australian Research Council (ARC, DP180103694_ bis SFC, TW, DM) unterstützt. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerhebung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts.

Zentrum für Bioinnovation, University of the Sunshine Coast, Maroochydore, QLD, 4558, Australien

Phong Phan, Di Liang, Min Zhao, Conor Fogarty, Tianfang Wang und Scott F. Cummins

School of Science, Technology and Engineering, University of the Sunshine Coast, Maroochydore, QLD, 4558, Australien

Phong Phan, Di Liang, Min Zhao, Conor Fogarty, Tianfang Wang und Scott F. Cummins

Abteilung für Biologie, St. Francis Xavier University, Antigonish, NS, B2G2W5, Kanada

Russell C. Wyeth

Labor für Molekulare Parasitologie, QIMR Berghofer Medical Research Institute, Brisbane, QLD, 4006, Australien

Mary G. Duke und Donald P. McManus

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Konzipierte und gestaltete die Studie und überwachte das Projekt: SFC und TW. Durchführte die Studie und Datenanalyse: PP, DL, CF, MZ und MD. Hat zur Analyse mit verschiedenen Tools beigetragen: DL, MZ und TW. Verfasste das Papier: PP, DL , RW, DPM und SFC Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Phong Phan oder Scott F. Cummins.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Phan, P., Liang, D., Zhao, M. et al. Die Analyse von Rhodopsin-G-Protein-gekoppelten Rezeptororthologen zeigt semiochemische Peptide für das Zusammenspiel von Parasit (Schistosoma mansoni) und Wirt (Biomphalaria glabrata). Sci Rep 12, 8243 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11996-x

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Eingegangen: 13. Januar 2022

Angenommen: 25. April 2022

Veröffentlicht: 17. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11996-x

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