Entstehung einer neuartigen Regulation und Expression von Kopffüßer-Genen durch große

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 2172 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Koleoid-Kopffüßer (Tintenfisch, Tintenfisch, Oktopus) haben das größte Nervensystem unter den Wirbellosen, das zusammen mit vielen abstammungsspezifischen morphologischen Merkmalen komplexe Verhaltensweisen ermöglicht. Die diesen Innovationen zugrunde liegende genomische Grundlage bleibt unbekannt. Mithilfe vergleichender und funktioneller Genomik am Modellkalmar Euprymna scolopes enthüllen wir die einzigartige genomische, topologische und regulatorische Organisation der Kopffüßergenome. Wir zeigen, dass die Genome von Coleoid-Kopffüßern im Vergleich zu anderen Tieren umfassend umstrukturiert wurden, was zur Entstehung von Hunderten eng verknüpfter und evolutionär einzigartiger Gencluster (Mikrosyntenien) führte. Solche neuartigen Mikrosynthesen entsprechen topologischen Kompartimenten mit einer ausgeprägten regulatorischen Struktur und tragen zu komplexen Expressionsmustern bei. Insbesondere identifizieren wir eine Reihe von Mikrosyntenien, die mit Cephalopod-Innovationen (MACIs) verbunden sind und die Expression des Nervensystems von Cephalopoden weitgehend bereichern. Wir gehen davon aus, dass die Entstehung von MACIs entscheidend für die Entwicklung des Nervensystems von Kopffüßern war, und schlagen vor, dass die mikrosyntenische Profilierung für das Verständnis von Kopffüßer-Innovationen von zentraler Bedeutung sein wird.

Kopffüßer haben das größte Nervensystem der Wirbellosen und verfügen über viele linienspezifische Anpassungen wie schnelle adaptive Tarnung, Arme mit Saugnäpfen und kameraartige Augen. Viele Merkmale von Kopffüßern entwickelten sich konvergent zu denen von Wirbeltieren, was sie zu einem attraktiven System für die Untersuchung der genetischen Grundlagen weitreichender Organismeninnovationen und der Wege hinter ihrer Evolution macht.

Auf genomischer Ebene wurde die Entstehung neuer Gene, umfangreiche Genduplikationen und weitreichende RNA-Editierung in Kopffüßergenomen beschrieben1. Erweiterungen von Genfamilien wie C2H2s, Protocadherinen und GPCRs sowie umfassende RNA-Bearbeitung ermöglichten die Diversifizierung proteinkodierender Transkripte im Nervensystem und spielten vermutlich eine wichtige Rolle bei seiner Entwicklung. Während ähnliche Innovationen aus Wirbeltiergenomen bekannt sind, sind die Mechanismen, die die Entwicklung dieser Merkmale vorantreiben, unterschiedlich: Wirbeltiere durchliefen mehrere Runden der Vervielfältigung des gesamten Genoms, die große Sätze von Genen mit mehreren Kopien und die Diversifizierung ihrer Funktionen hervorbrachten, es gibt keine Hinweise darauf für ähnliche Ereignisse bei Kopffüßern1,2,3. Im Gegensatz dazu wurde vermutet, dass die Linie der Coleoid-Kopffüßer (Tintenfische, Tintenfische, Tintenfische) eine groß angelegte Genomreorganisation durchlief2,3.

Eine Eigenschaft von Metazoengenomen besteht darin, dass die lokale Genordnung oder Mikrosyntenie auch zwischen entfernt verwandten Arten erhalten bleibt4,5,6. Diese Erhaltung wird durch funktionelle Studien zu regulatorischen Einschränkungen gestützt, die in genomischen Regulierungsblöcken (GRBs)4,5,7 gezeigt werden, sowie durch die Koexpression benachbarter Gene in Geweben oder Zelltypen8. Frühe Genomassemblierungen in mehreren Coleoiden deuten darauf hin, dass die lokale Genordnung stark gestört wurde, alte Mikrosynthesen aufgebrochen und zuvor nicht verknüpfte Gene zusammengeführt wurden2,3. Dieses Ereignis, möglicherweise auf der Ebene des gesamten Genoms, könnte Hunderte von Genfamilien betroffen haben und die Reihenfolge der Gene im Vergleich zum letzten gemeinsamen Vorfahren der Coleoid-Kopffüßer und anderer Weichtiere gestört haben. Das Ausmaß dieses Ereignisses ist schwer abzuschätzen, da es bei Kopffüßern an chromosomalen Ansammlungen mangelt. Um das Ausmaß der Genomreorganisation und ihre Auswirkungen auf die Biologie und Evolution des Kopffüßer-Genoms zu verstehen, untersuchen wir die neu entstehende Modellart Euprymna scolopes (hawaiianischer Bobtail-Tintenfisch). Diese Art steht seit über 30 Jahren im Mittelpunkt der Symbioseforschung9,10, ist aber aufgrund ihrer geringen Erwachsenengröße, der großen Eiergelege und der relativ einfachen Kultur auch ein attraktives Modellsystem für die Evolutions- und Entwicklungsforschung.

Um die regulatorische Landschaft im Genom von E. scolopes zu rekonstruieren, verwendeten wir Techniken zur Erfassung der chromosomalen Konformation (Hi-C) und offenen Chromatinprofilen (ATAC-seq) und sammelten zusätzliche Expressionsdaten. Hi-C ermöglichte es uns, sowohl die zuvor veröffentlichte Genomassemblierung von E. scolopes zu verbessern als auch die dreidimensionale Organisation des Genoms zu erfassen. Mithilfe vergleichender genomischer Ansätze beschreiben wir die globale Natur der Genomumordnung bei Coleoid-Kopffüßern und zeigen die Entstehung vieler mikrosyntener Regionen, die zuvor bei anderen Arten nicht verknüpft waren. Unsere Daten offenbaren auch Wechselwirkungen zwischen entfernten genomischen Loci (die topologische Organisation des Genoms), die Aufschluss über die dreidimensionale Organisation des E. scolopes-Genoms geben, sowie die Identifizierung von Genen, die sich in Regelkreisen und topologisch assoziierenden Domänen (TADs) befinden. Unsere offenen Chromatindaten offenbaren Regionen, die für Transkriptionsfaktoren zugänglich sind und somit möglicherweise regulatorische Elemente darstellen. Zusammengenommen ermöglichen uns diese Daten, Einblicke in die Auswirkungen evolutionärer Veränderungen der Genverknüpfungen und die Entstehung neuer Genregulationen zu gewinnen. Diese Studie liefert die Grundlage für das Verständnis der Evolution der Kopffüßergenome und mögliche Auswirkungen auf morphologische Neuheiten in dieser Gruppe.

Verknüpfungsinformationen aus der Erfassung der Chromosomenkonformation ermöglichten uns die Rekonstruktion von 46 Chromosomengerüsten in E. scolopes („Methoden“, Ergänzende Anmerkungen 1 und 2, Ergänzende Abb. 1a, b) basierend auf der veröffentlichten Baugruppe . Anschließend verglichen wir die Reihenfolge der Gene mit Orthologen, die in weiteren 24 Tierarten gefunden wurden, von Schwämmen bis zu Wirbeltieren, was es uns ermöglichte, mikrosyntenische Blöcke zu rekonstruieren, die zwischen verschiedenen Klassen geteilt wurden („Methoden“, Ergänzende Anmerkung 3, Ergänzende Abbildung 2a, Ergänzende Daten 1). . Kurz gesagt definieren wir mikrosyntenische Blöcke als mindestens drei oder mehr gleichzeitig auftretende orthologe Gene mit bis zu fünf dazwischen liegenden Genen ohne Einschränkungen hinsichtlich ihrer Kollinearität. Diese Definition der Mikrosyntenie führt zu den wenigsten falsch-positiven Blöcken (im Vergleich zu nur Genpaaren) und bietet gleichzeitig genügend Flexibilität, um syntenische Regionen zu erkennen, die einer lokalen Neuanordnung und Erweiterung unterzogen wurden. Wir entdecken 505 Mikrosyntenien, die nur bei Kopffüßern vorkommen. Dabei handelt es sich um Genblöcke, die nur bei E. scolopes und mindestens einer Krakenart in unmittelbarer Nähe zueinander vorkommen. Für die gleiche Artenprobenahme und die gleichen Mikrosyntenie-Nachweisparameter wären zufällig nur 2 Blöcke zu erwarten gewesen (Median aus 3 Randomisierungsrunden, wie in 6 beschrieben). Fünf dieser 505 Blöcke waren paralog. Insgesamt wurden nur 48 von 2290 Genen in diesen 505 Blöcken als Orphan-Gene ohne Homologie außerhalb von Kopffüßern identifiziert, während alle anderen Orthologe bei anderen Tieren aufweisen, was darauf hindeutet, dass der Ursprung der Mikrosyntenie eher auf Veränderungen der Genpositionen als auf neuen Genen zurückzuführen ist Entstehung von Genen. Diese Mikrosyntenien sind bei Coleoid-Kopffüßern trotz ihrer langen Divergenzzeit erhalten geblieben (Abb. 1b, c), was auf eine evolutionäre Einschränkung hindeutet, die diese Genblöcke zusammenhielt. In ähnlicher Weise zeigte ein Vergleich bei anderen Weichtieren wie der Jakobsmuschel Mizuhopecten yessoensis11 und der Muschel Crassostrea gigas, dass diese Arten eine viel geringere Anzahl Muschel-spezifischer Mikrosyntenien (152) gemeinsam haben. Um den Satz hochkonservierter Mikrosyntenblöcke abzuleiten, haben wir Mikrosyntenien rekonstruiert, die E. scolopes und mindestens sechs weiter entfernt verwandte Arten aus einem Satz von 23 Arten gemeinsam haben (ergänzende Abbildung 2). Wir haben 275 solcher Metazoen-Mikrosyntenien gefunden, die in der E. scolopes-Linie erhalten bleiben und vermutlich mindestens auf den letzten gemeinsamen bilateralen Vorfahren zurückgehen (Abb. 1c, ergänzende Abb. 2a, „Methoden“). Im Vergleich dazu behält die Muschel M. yessoensis eine ähnliche Anzahl metazoischer Mikrosyntenien bei (216). Diese Ergebnisse liefern Hinweise auf einen großflächigen mikrosynthetischen Zuwachs bei Coleoid-Kopffüßern.

a Foto eines Jungtiers von Euprymna scolopes. b Schematischer Baum mit Divergenzzeiten der wichtigsten Abstammungslinien der Kopffüßer von Deuterostomen und anderen Protostomen53,54. c Circos-Diagramm, das den Verlust von Syntenien, die in anderen Metazoen konserviert sind, und die Entstehung einer großen Anzahl neuer, Kopffüßer-spezifischer Mikrosyntenien innerhalb von Kopffüßern zeigt. Jede Linie stellt einen syntenischen Cluster dar, der von verschiedenen Arten gemeinsam genutzt wird. Orangefarbene Linien weisen auf syntenische Cluster hin, die mindestens sieben dieser 24 Arten gemeinsam haben (Vorfahren, Metazoen-Cluster); Grüne Linien stellen neuartige Mollusken-Syntenien dar, die von fünf oder mehr Mollusken gemeinsam genutzt werden, aber bei keiner Nicht-Mollusken-Art vorkommen. Blaue Linien stellen Kopffüßer-spezifische Syntenien dar, die entweder allen drei Kopffüßerarten (dunkelblau) oder zwei der drei Kopffüßerarten (hellblau) gemeinsam sind, aber bei keiner Nicht-Kopffüßerart vorkommen; graue Linien stellen andere Syntenien dar, die in keine der vorherigen Kategorien fallen. Abkürzungen: Aca – Acanthaster planci, Aqu – Amphimedon queenslandica, Bfl – Branchiostoma floridae, Cel – Caenorhabditis elegans, Cgi – Crassostrea gigas, Cmi – Callistoctopus minor, Cte – Capitella teleta, Dme – Drosophila melanogaster, Esc – Euprymna scolopes, Lgi – Lottia gigantea, Mle – Mnemiopsis leidyi, Mye – Mizuhopecten yessoensis, Nve – Nematostella vectensis, Obi – Octopus bimaculoides, Sko – Saccoglossus kowalevskii d Beispiel eines ganzen chromosomalen Gerüsts (rechts) von E. scolopes, das die Verteilung der Gendichte zeigt, Kopffüßer -spezifische (blau) und konservierte metazoische (orange) Syntenien. Einschub (links) mit den Positionen der Gene innerhalb zweier spezifischer syntenischer Blöcke.

Auf 44 von 46 Chromosomengerüsten sind sowohl Kopffüßer-spezifische als auch konservierte Mikrosyntenie-Blöcke von Metazoen vorhanden (wobei zwei Chromosomen zu klein sind, um Mikrosyntenien zu enthalten). Während einige Chromosomen einen höheren Anteil neuartiger Kopffüßer-Mikrosyntenien aufweisen (ergänzende Abbildung 1b, c), sind beide Mikrosyntenientypen im Genom vermischt (Abb. 1d). Dieses Ergebnis legt einen genomweiten Mechanismus für die Entstehung neuer Mikrosyntenien nahe. Die überwiegende Mehrheit der Einzelkopie-Gene (71 %), die 232 neuartige Kopffüßer-Mikrosyntenien umfassen, befinden sich auf verschiedenen Chromosomen in der Jakobsmuschel M. yessoensis. Da die Organisation des kürzlich veröffentlichten Nautilus-Genoms12 der anderer Mollusken ähnelt, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass beim Coleoid-Vorfahren entweder viele Translokationen oder Fusionen auf Chromosomenebene stattgefunden haben.

Neuartige Kopffüßer- und konservierte Metazoen-Mikrosyntenie weisen unterschiedliche genomische Eigenschaften auf. Neuartige Mikrosyntenien von Kopffüßern sind im Durchschnitt kleiner als die Mikrosyntenien von Metazoen, die noch in Kopffüßergenomen vorhanden sind (ergänzende Abbildung 2b), obwohl sie eine ähnliche Anzahl von Genen aufweisen (ergänzende Abbildung 2c). Während die Introns von Genen in Kopffüßer-spezifischen Mikrosyntenien kleiner sind als die von Metazoen-Mikrosyntenien, stammen die meisten Größenunterschiede aus intergenen Regionen (~0,2 kb im Vergleich zu ~7 kb Unterschied).

Wir finden auch Hinweise auf eine unterschiedliche Anreicherung funktioneller Kategorien zwischen den beiden Mikrosyntenietypen. Metazoische Mikrosyntenien6 sind unter anderem mit Signalwegkomponenten des Wnt-Signalwegs, des Neurotransmittertransports und der Exozytose synaptischer Vesikel, der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung, der negativen Transkriptionsregulation und der BMP-Signalwege angereichert. Gene in der neuartigen, Kopffüßer-spezifischen Mikrosyntenie hingegen spielen eine Rolle bei der Translation, Redoxprozessen, der Regulierung des speichergesteuerten Kalziumeintritts, der mRNA-Spaltung, dem Transport und der Chromatinorganisation (p-Werte <0,05) (Ergänzende Abb. 3).

Die dreidimensionale Chromatinstruktur einschließlich topologisch assoziierter Domänen (TADs) erleichtert entfernte regulatorische Interaktionen, die an der Genregulation beteiligt sind13,14. Während bisher nur sehr wenige Daten zur topologischen Organisation des Genoms von Wirbellosen vorliegen, stellten wir fest, dass im Vergleich zu den Daten, die für die TAD-Größen von Wirbeltieren bekannt sind, die Interaktionsabstände beim Tintenfisch im Allgemeinen größer waren (Abb. 2a, b, Ergänzende Anmerkung 4). TAD-Vorhersagetools (siehe „Methoden“) zeigen eine mittlere TAD-Größe von E. scolopes von 2,5 MB, im Vergleich zu einem Durchschnitt von 1,2 MB beim Menschen15. Darüber hinaus war die Verteilung der TAD-Größen bei E. scolopes erheblich breiter als beim Menschen, was auf eine höhere Variabilität schließen lässt.

a Oben: Hi-C-normalisierte Interaktionsmatrix bei 100 kb Auflösung für chromosomales Gerüst 10. Unten: Relative Hi-C-Anzahl und TAD-Grenzwerte, wie von Tadbit vorhergesagt (1 = am niedrigsten, 10 = am höchsten). b Violindiagramm der TAD-Größenverteilungen für menschliche und Euprymna-Scolopes, berechnet mit einer Auflösung von 100 kb, dargestellt in 100-kb-Bins. c CTCF-Bindungsmotiv, wie durch Homer-Motivsuche in 100 kbp der vorhergesagten TAD-Grenzen identifiziert. d Solvent Area Surface Exposure (SASA) pro bp für einzelne chromosomale Gerüste (beobachtet und zufällig). Konservierte Metazoen-Syntenie auf der X-Achse, Kopffüßer-spezifische Mikrosyntenie auf der Y-Achse. e Dreidimensionales Modell des chromosomalen Gerüsts 10 mit markierten neuen (blau) und konservierten (gelb) Mikrosyntenieorten. Linkes und rechtes Modell sind gleich, um 90° verschoben.

Bei Wirbeltieren wird die TAD-Bildung durch Proteine wie CTCF und Cohesin16,17 vermittelt. Wir schließen daraus, dass die gleichen Mechanismen, einschließlich CTCF und der Proteine Smc1 und Smc3 des Kohäsinkomplexes, im Genom von E. scolopes vorhanden sind und bei anderen Tieren konserviert sind, was darauf hindeutet, dass ähnliche Mechanismen bei Kopffüßern eingesetzt werden könnten (ergänzende Abbildung 4). Wir stellen auch fest, dass TAD-Grenzen für ein CCCTC-ähnliches Motiv angereichert sind, das an eine CTCF-Bindungsstelle erinnert (Abb. 2c, p = 1e−12, „Methoden“, Ergänzende Anmerkung 4).

Mehrere Studien legten die Möglichkeit einer Korrespondenz zwischen Mikrosyntenie und regulatorischen Domänen in Metazoengenomen nahe4,5,7,8,21,22,23. Um die Beziehung zwischen Mikrosyntenien und TADs zu verstehen, verglichen wir die Lokalisierung zufällig berechneter Mikrosyntenien, die denselben Eigenschaften wie unsere beobachteten Blöcke folgen, aber zufällig über das Genom verteilt sind, mit den beobachteten Mikrosyntenien („Methoden“). Wir stellen fest, dass konservierte Metazoen-Mikrosyntenien tendenziell in der Mitte der vorhergesagten TADs lokalisiert sind, wohingegen neue Kopffüßer-Mikrosyntenien gleichmäßiger verteilt zu sein scheinen (Abb. 3a).

a Verhältnis zwischen der Dichte des Zentrums beobachteter und randomisierter Mikrosyntenieorte innerhalb normalisierter TADs. Das Verhältnis nimmt bei Metazoen-Syntenien zum Zentrum der TADs hin zu und bei Kopffüßer-Syntenien ab. b Kompaktheit der neuartigen und metazoischen Mikrosyntenie im Vergleich zu Zufallssimulationen. Mikrosynthetische Cluster müssen mindestens 3 Gene enthalten. Wenn dem Baum weniger Gene annotiert wurden, wurden diese Cluster ausgeschlossen. Aufgetragen sind die Verhältnisse zwischen der Anzahl der Bins (bei 40 kb Hi-C-Auflösung, Cephalopoden-Mikrosyntenie-Bins n = 143.969, Metazoen-Mikrosyntenie-Bins n = 82.417, zufällige Kopffüßer-Mikrosyntenie-Bins n = 3.499.849, zufällige Metazoen-Mikrosyntenie-Bins n = 1.889.687) in mikrosyntenic Cluster (innerhalb von 7 und 25 Bins, gültige Mikrosyntenien: Kopffüßer n = 265, Metazoon n = 125, zufälliger Kopffüßer n = 4265, zufälliger Metazoan n = 2180) und die Anzahl der „nachkommenden“ Bins vom letzten gemeinsamen Vorfahren dieser mikrosyntenischen Bins („Methoden“, Kopffüßer n = 143.969, Metazoen n = 82.417, zufälliger Kopffüßer n = 3.499.849, zufälliger Metazoen n = 1.889.687). Das Verhältnis (n = 6835) der Anzahl der Klassen in einem Cluster und der Anzahl der Klassen im Unterbaum wurde durch einen zweiseitigen Wilcoxon-Rangsummentest verglichen, bei dem die verknüpften Gruppen verglichen wurden (****p < 0,0001, * < 0,05, ns: nicht signifikant). Je näher das Verhältnis bei 1 liegt, desto geringer ist der Unterschied zwischen der Größe des syntenischen Blocks und der Anzahl der Bins in einem extrahierten Baum. Violindiagramme – Verteilung, Kästchen – Interquartilbereich (Kopffüßer = untere 0,06, obere 0,56, Metazoen = untere 0,01, obere 0,58, zufällige Kopffüßer = untere 0,01, obere 0,49, zufällige Metazoen = untere 0,01, obere 0,46), Balken – Median (Kopffüßer = 0,31, Metazoon = 0,28, zufälliger Kopffüßer = 0,18, zufälliger Metazoon = 0,17), Whiskers – am weitesten entfernte Probe innerhalb des 1,5-fachen Interquartilbereichs (Kopffüßer = min. 0,002, max. 0,94, Metazoon = min. 0,002, max. 0,95, zufälliger Kopffüßer = min. 0,002, max. 0,96, zufälliger Metazoon = min. 0,002, max. 0,96), maximale und minimale Verhältnisse: Kopffüßer = min. 0,00189, max. = 0,941, Metazoon = min. 0,00217, max. = 0,952, zufälliger Kopffüßer = min. 0,00151, max. 0,962, zufälliger Metazoon = min. 0,00150 , maximal 0,96. c Koexpressionskorrelation von Genen in mikrosyntenischen Clustern (Kopffüßer n = 476, Metazoen n = 236, zufällige Kopffüßer n = 6925, zufällige Metazoen n = 4038). Die Koexpressionskorrelation metazoischer Syntenien ist höher als die von Kopffüßer-spezifischen Syntenien oder Zufallsclustern (****p < 0,0001, ***p < 0,001, * < 0,05). Geigendiagramme – Verteilung, Kästchen – am weitesten entfernte Stichprobe innerhalb des 1,5-fachen Interquartilbereichs (Kopffüßer = min −0,69, max. 0,87, Metazoon = min −0,63, max. 1,0, zufälliger Kopffüßer = min −0,72, max. 0,95, zufälliger Metazoon min −0,66, max 0,9), Balken – Median (Kopffüßer = 0,05, Metazoen = 0,15, zufällige Kopffüßer = 0,07670835, zufällige Metazoen = 0,07) Ausreißer wurden aus diesen Zahlen ausgeschlossen. Maximal- und Minimalwerte: jeweils −1 und 1. d Clusterung der mittleren Expression pro Syntenie-Cluster, farbcodiert nach Syntenie-Typ, Expression in adulten Geweben von Euprymna scolopes. Syntenische Cluster bilden acht Expressionsmodule mit spezifischen Expressionsmustern. Die Ausdrucksmatrix ist Z-Score-normalisiert. Lichtorgel – E. Scolopes-spezifisches Organ, das Symbionten beherbergt, akzessorische Nidamentaldrüse – weibliches spezifisches Fortpflanzungsorgan einiger Tintenfischarten. e Anmerkung zur ATAC-Peak-Lage in der späten Organogenese. Peaks, die mit Kopffüßer-spezifischen Mikrosyntenien assoziiert sind, werden häufiger in intronischen Regionen gefunden. Promotor definiert als +10 kb und –10 kb vorhergesagte Transkriptionsstartstelle.

Um die Beziehungen genomischer Regionen und ihre Wechselwirkungen unabhängig von TAD-Vorhersagen weiter zu untersuchen, haben wir eine Baumstruktur berechnet, die die Organisation jedes chromosomalen Gerüsts widerspiegelt („Methoden“, Ergänzende Anmerkung 4). Jeder Gabelungszweig spiegelt die Beziehungen der Genomregionen in der Hi-C-Signalstärke wider und ermöglicht es uns, die Interaktionsintensitäten in Mikrosyntenien zu verfolgen (Abb. 3b). Überraschenderweise stellten wir fest, dass neuartige Mikrosyntenien im Vergleich zu zufällig ausgewählten Syntenien mit größerer Wahrscheinlichkeit enge Interaktionsbereiche bilden, die sich in Teilbäumen mit wenigen Verzweigungen widerspiegeln (Abb. 3b). Dieses Ergebnis weist auf einen signifikant höheren Grad der Kompartimentierung sowohl bei Kopffüßern als auch bei Mikrosyntenien der Vorfahren hin.

Motiviert durch die Bedeutung der dreidimensionalen Genomarchitektur und der mikrosyntenischen Co-Lokalisierung in Euprymna-Scolopes wurde eine dreidimensionale Modellierung auf der Grundlage von Hi-C-Interaktionsmatrizen durchgeführt („Methoden“, ergänzende Abbildung 5, ergänzende Anmerkung 5), um einen tieferen Einblick zu erhalten Verständnis räumlicher Eigenschaften und Co-Lokalisierung sowohl neuer als auch alter mikrosyntener Regionen innerhalb modellierter chromosomaler Gerüste. Dreidimensionale Modelle zeigten, dass neuartige Mikrosyntenien von Kopffüßern andere räumliche Eigenschaften als alte Mikrosyntenien aufweisen. Insbesondere zeigten beide Synteny-Typen im Vergleich zu Zufallsverteilungen eine unterschiedliche Lösungsmittelzugänglichkeit auf einigen Chromosomen (Abb. 2d). Darüber hinaus waren neuartige Kopffüßer-Mikrosyntenien im Durchschnitt weniger vergraben und bedeckten somit einen größeren Teil der Chromosomenoberfläche (ergänzende Abbildung 6). Dieses Ergebnis stand im Gegensatz zu den konservierten Metazoen-Mikrosyntenien, die tendenziell an der Bildung des chromosomalen Kerns beteiligt sind (Abb. 2e, ergänzende Abb. 6). Da die neuen Mikrosyntenien transkriptionell aktiv sind (Abb. 3, siehe unten), spiegelt ihre Lage auf der Chromosomenoberfläche möglicherweise eine hochdynamische interchromosomale Regulation wider und ist außerdem für Transkriptionsfaktoren besser zugänglich.

Der GC-Gehalt der Metazoen- und Kopffüßer-spezifischen Mikrosyntenie wurde zusammen mit Vorhersagen von A/B-Kompartimenten basierend auf der Hi-C-Interaktionsmatrix („Methoden“) bewertet. Die Analyse lieferte keinen ausreichenden Beweis dafür, dass einer der mykrosyntenischen Typen in einem der Kompartimente häufiger vorkommt. Bis weitere experimentelle Daten (z. B. Methylierungs- und Acetylierungsprofile) für Euprymna scolopes verfügbar sind, können wir die Verteilung der Kopffüßer-spezifischen und metazoischen Mikrosyntenie innerhalb der A/B-Kompartimente nicht genau ableiten.

Zusammengenommen lassen die starke Genomkonservierung unter sequenzierten Kopffüßern, die vergleichsweise dichte Verpackung (kurze Abstände zwischen Genen) von Mikrosynten-Clustern und ihre vorherrschende Assoziation mit definierten Unterkompartimenten innerhalb erkannter TADs auf einen starken Selektionsdruck zur Aufrechterhaltung der regulatorischen Eigenschaften neuer Mikrosynten-Einheiten im Kopffüßer schließen Genome.

Die Koexpression syntenischer Gene ist eine wichtige Eigenschaft, die deren Regulierung widerspiegeln kann. Gene in Kopffüßer-spezifischen Mikrosyntenien werden trotz ihrer engen Co-Lokalisierung tendenziell nicht co-exprimiert („Methoden“, Ergänzende Anmerkung 7). Im Vergleich zu zufällig ausgewählten Gengruppen, die einer ähnlichen Verteilung wie die beobachteten neuartigen Mikrosyntenien folgen, ist der mittlere Koexpressionskoeffizient in den beobachteten Daten sogar geringfügig niedriger (Wilcoxon-Test, p ≤ 0,05, Abb. 3c). Im Gegensatz dazu zeigen konservierte Metazoen-Mikrosyntenien im Vergleich zu simulierten Mikrosyntenien eine signifikante Koexpression (Wilcoxon-Test, p ≤ 0,001) (Abb. 3c). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass Gene in der Metazoen-Mikrosyntenie dazu neigen, in einem definierten Satz von Geweben gemeinsam zu exprimieren, ähnlich wie frühere Erkenntnisse zur antiken Metazoen-Mikrosyntenie8. Ein ähnliches Muster wurde auch für die Koexpression neuer und konservierter Metazoen-Mikrosyntenien in O. bimaculoides beobachtet (ergänzende Abbildung 7a). Keine Art von Mikrosyntenie zeigte eine Anreicherung der Expressionsspezifität in einem bestimmten Gewebe24.

Um Expressionsprofile weiter zu kategorisieren, untersuchten wir die durchschnittliche Expression syntenischer Regionen. Diese Analyse zeigte komplexe Muster, die in acht verschiedenen Expressionsmodulen in erwachsenen E. scolopes-Geweben auftraten (Abb. 3d, „Methoden“, Ergänzende Anmerkung 7). Obwohl die meisten Module ähnliche Anteile beider Mikrosyntenietypen aufwiesen, bildeten einige Cluster Ausreißer. Beispielsweise zeigte Modul 8 einen augenspezifischen Ausdruck und wurde größtenteils von Metazoen-Mikrosyntenie dominiert. Interessanterweise wurden Cluster, die mehrere Nervengewebe umfassen, insbesondere die Module 2 und 4, mit neuartigen Kopffüßer-Mikrosyntenien angereichert (genaue Fisher-Test-p-Werte ≤0,02 bzw. ≤1e−07). Ihre Orthologen wurden in ähnlicher Weise in Nervengeweben von O. bimaculoides exprimiert, wobei neuartige Mikrosyntenien in Modulen dominierten, die mit der stärksten Gehirnexpression verbunden waren (ergänzende Abbildung 7b). Die Gesamtmodulkorrespondenz wurde jedoch durch den Unterschied bei der Gewebeentnahme beeinflusst (ergänzende Abbildung 7c).

Als nächstes wollten wir untersuchen, ob diese Expressionsmuster aufgrund eines einzelnen stark exprimierten Gens pro syntenischem Block verzerrt sind. Die überwiegende Mehrheit der mikrosynthetischen Blöcke (76 %, ergänzende Abbildung 8b) weist ein Gen auf, das zu mehr als 50 % der kumulativen Expression beiträgt. Anschließend haben wir die relativen Expressionsniveaus in den Geweben pro Gen berechnet und für jeden Block gemittelt. Dies zeigt, dass die Identitäten der gesamten Expressionsmodule erhalten bleiben (ergänzende Abbildung 8a). Im Allgemeinen korreliert die Expressionsvarianz mit der absoluten Expression von Genen (ergänzende Abbildung 8c). In einigen Metazoen-Syntenien, insbesondere in den Geweben, die ein Modul definieren, war die Varianz jedoch gering, was auf höhere Koexpressionsbeschränkungen hinweist (ergänzende Abbildung 8c).

Zusammengenommen verdeutlichen diese Ergebnisse den komplexen Beitrag mikrosyntener Regionen zur Expressionsdomäne und identifizieren eine Diskrepanz in der Koexpressionsdynamik zwischen neuartigen Mikrosyntenien von Kopffüßern und Metazoen. Dieser Mangel an Koexpression in Mikrosyntenien von Kopffüßern weist auf einen möglicherweise unterschiedlichen Modus ihrer Genregulation hin.

Expressionsmodule zeigten spezifische Signaturen der damit verbundenen regulatorischen Motive. Wir haben regulatorische Regionen anhand von Assay-Daten für Transposase-zugängliches Chromatin (ATAC-seq25) aus einem Entwicklungszeitverlauf vorhergesagt („Methoden“, Ergänzende Anmerkung 9). Die mit jedem Expressionscluster vorhergesagten Peaks wurden dann weiter auf die Anreicherung bekannter Transkriptionsfaktormotive analysiert, getrennt für Kopffüßer und alte Mikrosyntenie („Methoden“, Ergänzende Daten 2). Wir stellen fest, dass das Cephalopoden-Mikrosynteniemodul 2, das mit mehreren Nervengeweben assoziiert ist, mit den Transkriptionsfaktoren-Bindungsmotiven Chop26, E2F127, NeuroG228, COUP-TFII29 und Atf430 angereichert wurde, die an der Differenzierung des Nervensystems und den Entwicklungstranskriptionsfaktoren ZBTB18, Esrrb, Tcf21 beteiligt sind , Pitx1, GATA in allen drei Entwicklungsstadien (p < 1e−3). Modul 4 wurde in ähnlicher Weise in allen drei Entwicklungsstadien mit Transkriptionsfaktor-Bindungsmotiven angereichert, die am Nervensystem und der allgemeinen Entwicklung beteiligt sind, wie Tcf3, TCFL2, GATA, Tcf21 und Pitx1 (p < 1e−3). Dies deutet auf ein gemeinsames Regulationsschema hin, das für die Genexpression in jedem der Expressionsmodule verantwortlich ist, und auf eine Assoziation dieser Motive mit der neuartigen Mikrosyntenie von Kopffüßern.

Zur Ergänzung unserer ATAC-seq-Daten führten wir Gesamtgenom-Alignments zwischen verfügbaren Kopffüßergenomen durch, wobei wir unterschiedliche Alignment-Ähnlichkeits- und Längenschwellenwerte verwendeten („Methoden“, Ergänzende Anmerkung 8, Ergänzende Tabelle 5 und Ergänzende Abbildung 9). Dies half bei der Identifizierung potenzieller konservierter nichtkodierender Elemente (CNEs) und ihrer Assoziation mit Genkörpern und der Genomtopologie („Methoden“, ergänzende Abbildung 10, ergänzende Anmerkung 8). Aufgrund der evolutionären Distanz zwischen den Abstammungslinien von Tintenfischen und Kraken ergab unser Ansatz nur 1187 CNE-Kandidaten für Coleoid-Kopffüßer mit einer Ähnlichkeitsschwelle von 0,95 und einer Mindestgröße von 100 bp (Ergänzungstabelle 5), von denen 613 auf Genmerkmale lokalisiert werden konnten ( Ergänzende Abbildung 10a–c). 139 waren mit neuartigen Kopffüßer-Mikrosyntenien (innerhalb oder innerhalb von 1 kb der Mikrosyntenie) assoziiert, 73 mit Metazoen-Syntenien innerhalb oder innerhalb von 1 kb der Mikrosyntenie) und 401 befanden sich außerhalb jeglicher Syntenien (ergänzende Abbildung 10b). Nur 12 der 1187 Kandidaten hatten eine Überlappung mit ATAC-seq-Peaks (Ergänzungstabelle 5). Für CNEs, die in Tintenfischgenomen gemeinsam sind, fanden wir 42920 mutmaßliche CNEs mit einer Ähnlichkeitsschwelle von 0, 95 und einer Mindestgröße von 100 bp (Ergänzungstabelle 5), von denen 13889 auf Genmerkmale lokalisiert werden konnten (Ergänzungsabbildung 10a – c). 2444 waren mit neuartiger Kopffüßer-Mikrosyntenie (innerhalb oder innerhalb von 1 kb der Mikrosyntenie) assoziiert, 3255 mit Metazoen-Syntenie und 8190 befanden sich in der Nähe von Genen außerhalb jeglicher Syntenie (ergänzende Abbildung 10c). Ebenso überlappten nur sehr wenige mit ATAC-Peaks (14). Daher bleibt die regulatorische Rolle dieser Regionen unklar.

Ein möglicher Beitrag zu dieser Beobachtung könnte der hohe evolutionäre Umsatz regulatorischer Regionen innerhalb der Tintenfischlinie sein, der die Erkenntnisse schmälert, die aus Genom-Alignment-/Konservierungs-basierten Schlussfolgerungen gewonnen werden. Kopffüßergenome sind groß, wobei über 50 % der Genomlänge auf repetitive Elemente zurückzuführen sind2,3. Wir haben daher die transponierbare Elementzusammensetzung von ATAC-seq-Peaks bewertet, die mit mikrosynthetischen Clustern verbunden sind. Beide Mikrosyntenietypen zeigten einen durchschnittlichen Wiederholungsgehalt von 40 %. ATAC-seq-Peaksequenzen in Mikrosyntenien von Kopffüßern in E. scolopes zeigten einen erhöhten Gehalt an repetitiven Elementen von 82 % und waren am häufigsten mit LINE/CR1-Zenon-Elementen assoziiert (44 %, verglichen mit 35 % in Mikrosyntenen von Metazoen). Die LINE/CR1-Erweiterung wurde als die häufigste und spezifischste erweiterte Wiederholungselementklasse in der Abstammungslinie der Tintenfische (E. scolopes) identifiziert3.

Die Co-Lokalisierung konservierter Gene kann durch regulatorische Regionen innerhalb eines benachbarten Gens erklärt werden, auch wenn die Funktion des Gens möglicherweise nicht miteinander in Zusammenhang steht (das Bystander-Szenario), zusammen einen genomischen regulatorischen Block (GRB)4,5 bilden oder über gemeinsame regulatorische Elemente Kontrolle der Expression aller syntenischen Gene, was zu einer höheren Koexpression führt8. Unser Mikrosyntenie-Ansatz ist von dieser Unterscheidung unabhängig und konzentriert sich auf jede konservierte Co-Lokalisierung von drei oder mehr Genen. Wir können unsere Daten daher verwenden, um die Neigung von Metazoen- oder Kopffüßer-Mikrosyntenien, bekannten funktionellen Mikrosyntenenmodellen zu entsprechen, unabhängig zu profilieren. Die Lage der ATAC-seq-Peaks innerhalb der Mikrosyntenie-Cluster zeigt, dass offene Chromatinregionen, die mit Kopffüßer-spezifischer Mikrosyntenie assoziiert sind, häufiger in Introns gefunden wurden als Peaks, die in konservierten Metazoen-Mikrosyntenien oder anderen nicht-syntenischen Genen gefunden wurden (Abb. 3e, Fishers genauer Test). p < 1e−5). Interessanterweise zeigte die CNE-Verteilung, insbesondere der von Tintenfischen gemeinsam genutzten CNEs, trotz geringer Überlappung eine signifikante Lokalisierung in distalen Regionen in Metazoen-Syntenien (exakter Fisher-Test p <2,2e−16) (ergänzende Abbildung 10). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass neuartige Kopffüßer-Mikrosyntenien im Gegensatz zu konservierteren Mikrosyntenien eher dem GRB-Szenario ähneln, insbesondere dem Bystander-Modell, bei dem mutmaßliche Enhancer in nahe beieinander liegenden (Bystander-)Genen innerhalb desselben Mikrosynten-Clusters gefunden werden und möglicherweise distal fehlen Regulierungsbereiche. Diese Beobachtung könnte auch den Befund einer schwächeren Koexpression mikrosyntener Gene in Cepholopoden-spezifischer Mikrosyntenie im Vergleich zu älteren, konservierten Mikrosyntenien ergänzen.

Angesichts dieser Erkenntnisse versuchten wir weiter, die potenzielle Funktion neuartiger Kopffüßer-Mikrosyntenien in den Expressionsmodulen 2 und 4 zu untersuchen, die den höchsten Beitrag zu neuronalen Gewebeexpressionsdomänen zeigten. Solche Mikrosyntenien können als nützlicher Testsatz funktioneller Mikrosyntenien angesehen werden, die an der Entwicklung des Nervensystems von Kopffüßern beteiligt waren. Wir untersuchten daher die genomische Umordnung, die regulatorische Landschaft und die Expression von Genen innerhalb einer der repräsentativen Kopffüßer-spezifischen Mikrosyntenien aus Expressionsmodul 2. Es handelte sich um einen der Cluster mit der höchsten Anzahl an Genen, die für das Ceramid-1-Phosphat-Transferprotein kodieren , Phenylalanin-tRNA-Ligase, Spleißfaktor-3B-Untereinheit, Integratorkomplex-Untereinheit und Amyloid-Protein-bindendes Protein. Orthologe dieser Mikrosyntenie waren in Jakobsmuscheln weit über zwei Chromosomen verteilt (Abb. 4a), waren jedoch im Genom von E. scolopes dicht gepackt, fast ohne intergenen Raum und mit einigen dominanten ATAC-Peaks an einem Ende des Clusters im Intron von Phenylalanin -tRNA-Ligase (Abb. 4b). Ähnlich wie der allgemeine Trend impliziert diese Häufung bei Kopffüßern entweder mehrere lokale Translokationen oder eine groß angelegte chromosomale Fusion, gefolgt von Umlagerungen. Der Cluster war in der Mitte des vorhergesagten TAD lokalisiert (Abb. 4b), in der Nähe einer anderen neuen mikrosynthetischen Einheit (aus demselben Expressionsmodul). Zusammen bilden diese beiden Einheiten ein Kompartiment mit hoher Hi-C-Wechselwirkungsdichte, getrennt vom nächstgelegenen Metazoan-Mikrosyntenkompartiment und den zugehörigen ATAC-Peaks (Abb. 4b). In unserem dreidimensionalen Chromosomenmodell wurde diese Mikrosyntenie auch auf der Oberfläche des Chromosomengerüsts 2 gefunden (Abb. 4c). Interessanterweise zeigen die Gene in diesem Cluster eine Expression des Nervensystems sowohl bei Jakobsmuscheln als auch bei E. scolopes (Abb. 5a, Ergänzende Anmerkung 10). Obwohl einige dieser Gene als reine Stoffwechsel- oder Haushaltsgene betrachtet werden, ist bekannt, dass sie bei Wirbeltieren eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Aktivität des Nervensystems spielen31,32,33,34,35. Wir führten eine In-situ-Hybridisierung durch, um die Genexpression während der Entwicklung in E. scolopes-Embryonen sichtbar zu machen, und bestätigten die Expression in allen wichtigen zentralen Gehirnregionen (Abb. 5b, c, Ergänzende Anmerkung 11). Wir haben jedoch auch eine Expression in anderen neuartigen Geweben und Organen von Kopffüßern festgestellt, beispielsweise in den axialen Nervensträngen sowie im Herzen und in den Kiemen (Abb. 5b, c, ergänzende Abb. 11). Dieses Ergebnis liefert Hinweise darauf, dass dieser Mikrosyntenie-Cluster und seine Geschwister aus Expressionsmodul 2 funktionelle Mikrosyntenie vom Bystander-Modelltyp umfassen könnten, die entscheidend zur Entstehung neuer Expressionsdomänen von Kopffüßern beitrug. Allgemeiner könnte die Beobachtung von Mikrosyntenien im Zusammenhang mit Kopffüßer-Innovationen (MACIs) und deren weitere Untersuchung dazu beitragen, die Entwicklung komplexer Expressionsmuster im Gewebe von Kopffüßern zu analysieren.

a Lage orthologer Gene eines der MACIs in Mizuhopecten yessoensis. Die Gene befinden sich auf zwei getrennten Chromosomen (oben – gesamtes Chromosom, unten – vergrößern, schwarz – Gendichte, blau – Position orthologer Gene), mit vielen dazwischen liegenden Genen. Unten sind Scallop-Orthologe von Genen im Mikrosynten-Cluster dargestellt, die blau hervorgehoben sind. b Gene desselben Clusters in Euprymna scolopes. Die Gene (blau hervorgehoben) sind dicht gepackt auf einem chromosomalen Gerüst mit nur einem dazwischenliegenden Gen (oben – gesamtes chromosomales Gerüst, unten – Vergrößern, orange – konservierte Metazoen-Mikrosynten-Cluster, blau – Kopffüßer-spezifische Mikrosynten-Cluster). Der Cluster befindet sich innerhalb eines TAD. Zwei große ATAC-seq-Peaks sind in intronischen Regionen des letzten Gens des Clusters in drei Entwicklungsstadien vorhanden (y-Achse – Signalwert). Die RNA-seq-Read-Anzahl von drei Entwicklungsstadien zeigt mehrere kleine Peaks in der Region des Clusters (y-Achse – Read-Anzahl). Frühes Stadium – frühe Organogenese, Stadium 20, mittleres Stadium – späte Organogenese, Stadium 24/25, spätes Stadium – kurz vor dem Schlüpfen, Stadium 28/29. c Dreidimensionale Rekonstruktion des chromosomalen Gerüsts 2. Der Kopffüßer-spezifische syntenische Cluster befindet sich auf der Oberfläche. Linke und rechte Ansicht sind um 90° verschoben.

eine Heatmap, die die Expression orthologer Gene des Kopffüßer-spezifischen Clusters in Geweben erwachsener Jakobsmuscheln und E. scolopes zeigt und die neuronale Expression bei beiden Arten zeigt. Die Maßstabsleiste zeigt die Z-Score-normalisierten Ausdrucksebenen pro Zeile an. b Schema des Spätstadiums (Stadium 27–29) Anatomie von E. scolopes und Abschnitt des Jungtiers. c Expression von MACI-Genen in Nervengeweben und inneren Organen später Entwicklungsstadien von E. scolopes. Alle Gene werden in verschiedenen Hirnlappen exprimiert, am häufigsten im ASM und PSM. Lichtexpressionsmuster sind in den meisten Genen in den Sehlappen, der Verdauungsdrüse und dem Darm vorhanden. Die Expressionsmuster unterscheiden sich in Intensität und Verteilung von Beta-Tubulin, das als Kontrolle für seine panneuronale Expressionsdomäne ausgewählt wurde. Maßstabsbalken = 100 µm. ASM vordere subösophageale Masse, DG Verdauungsdrüse, ES Speiseröhre, FT Trichterorgan, GI Kiemen, INT Darm, IS Tintensack, IYO interner Eigelb, OL Optikuslappen, PSM hintere subösophageale Masse, ST Statozyste. Gepunktete Kreise – Farbüberfüllung.

Zusammenfassend präsentieren wir eine umfassende Studie zur topologischen und regulatorischen Genomorganisation bei einem Coleoid-Kopffüßer. Charakteristisch für die Genome von Kopffüßern sind Wechselwirkungen im Megabasenbereich und sie wurden von einer genomweiten syntenischen Reorganisation beeinflusst, deren Ausmaß bei Tiergenomen selten ist. Diese Umstrukturierung führte zur Entstehung von Hunderten kopffüßerspezifischer Mikrosyntenien, die mit kompakten topologischen Regionen und einer bestimmten Art der Genregulation verbunden sind. Ihre mutmaßlichen regulatorischen Sequenzen befanden sich oft innerhalb der Introns von Genen innerhalb desselben mikrosynthetischen Clusters, wie für die funktionelle Genverknüpfung im Bystander-Modell vorgeschlagen wurde. Unsere Analyse der mikrosyntenischen Expressionsdaten ergab komplexe Expressionsmuster neuartiger Mikrosyntenien, die mit einem bestimmten Satz neuronaler Gewebe von Kopffüßern und anderen neuartigen Organen verbunden sind. Wir identifizieren zwei solcher Expressionsmodule, die am stärksten von der Entstehung neuartiger Kopffüßer-Mikrosyntenien betroffen sind und jeweils mit einer spezifischen regulatorischen Signatur verbunden sind. Wir gehen davon aus, dass dieses syntenische „Lock-in“, also die hohe Kompaktheit und regulatorische Straffung, für die Entstehung und Erweiterung der Expressionsdomänen des neuralen Gewebes von Mollusken der Vorfahren verantwortlich war. Da ein Großteil der Molekularbiologie von Kopffüßern nach wie vor schwer fassbar ist, schlägt unsere Studie die Verwendung dieser mit Kopffüßer-Innovationen verbundenen Mikrosyntenien (MACIs) vor, um mit der Aufklärung molekularer Veränderungen zu beginnen, die mit Innovationen in der Entwicklung und im Organismus von Kopffüßern verbunden sind. Diese Studie schafft die Grundlage für die weitere Untersuchung von MACIs und ihrer Rolle bei der Entstehung neuer Expressionsdomänen und organisatorischer Innovationen bei Kopffüßern.

E. scolopes-Eier wurden aus Kulturen gewonnen und im Wiener Zoo oder im Meeresbiologischen Labor aufbewahrt. Alle Arbeiten wurden in Übereinstimmung mit der EU-Richtlinie 2010/63/EU über die Verwendung von Kopffüßern und den AAALAC-Richtlinien für die Pflege und das Wohlergehen von Kopffüßern36 durchgeführt. Ausgewachsene E. scolopes laichen auf natürliche Weise in ihren Becken, und die Embryonen werden kurz nach dem Laichen gesammelt und in einem geschlossenen, mit künstlichem Meerwasser gefüllten Aquariumsystem gehalten. Die Embryonen entwickelten sich bis zum entsprechenden Stadium und wurden vor der Verwendung mit 2 % Ethanol anästhesiert37,38,39.

Die Vorbereitung der Hi-C-Proben wurde wie in der Ergänzenden Anmerkung 2 beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, Hi-C-Proben wurden im Entwicklungsstadium 2740 mit 30 gepoolten Embryonen unter Verwendung des sechs Basen umfassenden Restriktionsenzyms Hind3 erzeugt. Die Paired-End-Sequenzierung von 50 bp wurde auf einem Illumina HiSeq2500 durchgeführt. Hi-C-Reads wurden mit dem Referenzgenom abgeglichen (ausgenommen Gerüste <50.000), was zu über 106 Millionen gültigen Interaktionspaaren führte (Ausrichtungsrate ~71 %). Ausgerichtete Lesevorgänge wurden verwendet, um das Genom mit chromosomalen Gerüsten zu verbinden. Die Montagestatistiken sind in der Ergänzenden Anmerkung 2 zusammengefasst. Rohe Hi-C-Reads wurden dann erneut den neuen chromosomalen Gerüsten zugeordnet, wodurch über 106 Millionen gültige Interaktionspaare wiederhergestellt wurden (Ausrichtungsrate ~ 71 %). Die dreidimensionale Modellierung chromosomaler Gerüste wird in der Ergänzenden Anmerkung 3 beschrieben. Für menschliche Proben wurden Hi-C-Proben von B-Lymphoblastoiden von NCBI heruntergeladen (Ref. 41, SRR1658570, HIC001) und mit dem menschlichen Referenzgenom (GRCh38.p12) abgeglichen ) und erhält über 144 Millionen gültige Interaktionspaare (~73 % Ausrichtungsrate).

Die Genorthologie wurde anhand von 27 Arten aller wichtigen Metazoengruppen rekonstruiert. Die Mikrosyntenie wurde mit hauseigenen Tools berechnet, wie in der Ergänzenden Anmerkung 3 ausführlich beschrieben. Die Metazoen-Syntenie wurde als alle syntenischen Blöcke definiert, die von mindestens sieben anderen Arten gemeinsam genutzt werden. Neuartige, Kopffüßer-spezifische Syntenie wurde als Syntenie definiert, die E. scolopes und mindestens eine Krakenart gemeinsam haben. Zufällige Mikrosyntenien wurden nach der Verteilung der beobachteten Syntenien modelliert, wie in Lit. beschrieben. 8 für 20 Iterationen. Weitere Einzelheiten zu den Skripten und Schritten finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 3.

TADs für E. scolopes und Human wurden mit Tadbit42, dem Tadbit-Algorithmus und mit HiCExplorer43 aufgerufen. Die TADs von E. scolopes wurden gemittelt und die Position der Mitte jedes syntenischen Clusters kartiert, um die Verteilung der Syntenien innerhalb der TADs zu analysieren. Wenn sich Syntenien über mehrere TADs erstreckten, wurde nur das TAD berücksichtigt, das die Mitte dieser Syntenie abbildet. Um die Topologie mikrosynthetischer Cluster weiter zu analysieren, wurde die normalisierte Hi-C-Interaktionsmatrix verwendet, um jedes Bin anhand der Bin-Wechselwirkungsstärke zu seinem nächsten Nachbarn zu gruppieren. Auf diese Weise wurde ein Interaktionscladogramm für jedes Chromosom rekonstruiert. Um zu verstehen, wie gut eine syntenische Region durch ihre Interaktionen definiert ist, haben wir den letzten gemeinsamen Vorfahren dieser Region (dh die Bins in dieser Region) aus dem gesamten Baum, aus dem das Chromosom besteht, extrahiert. Anschließend wurde das Verhältnis zwischen diesen Unterbäumen und der Anzahl der Bins in einem syntenischen Cluster berechnet und die Unterschiede zwischen den Gruppen mithilfe des Wilcoxon-Tests getestet.

Das Zentrum jedes syntenischen Clusters wurde innerhalb der vorhergesagten TAD-Grenzen lokalisiert. Die Positionen wurden dann normalisiert und für beobachtete und zufällige Mikrosyntenien aufgezeichnet. Um die Unterschiede zwischen beobachteten und zufälligen zu veranschaulichen, wurde das Verhältnis zwischen den jeweiligen Dichten berechnet und an normalisierten TAD-Positionen aufgetragen (Abb. 3a). Eine Dichte über eins bedeutet eine Anreicherung der beobachteten Syntenie im Vergleich zu zufälligen Clustern. Eine Dichte von weniger als eins bedeutet im Vergleich zu zufälligen Clustern ein vermindertes Signal der beobachteten Syntenie. Zufällige Syntenie stellt Cluster dar, die aus der Verteilung beobachteter Blöcke an zufälligen Stellen im Genom entnommen werden.

Koexpressionskoeffizienten für adulte Gewebe von E. scolopes und O. bimaculoides wurden wie in Lit. beschrieben berechnet. 8. Eine detaillierte Beschreibung der Schritte finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 7.

Die Genome von E. scolopes und O. bimaculoides sowie von E. scolopes und A. dux wurden mit Megablast abgeglichen, wobei E. scolopes als Abfragesequenz verwendet wurde. Es wurden fünf verschiedene Einstellungen für BLAST44-Ähnlichkeitswerte (-perc_identity) verwendet: 0 %, 70 %, 80 %, 95 % und 98 % (Ergänzende Abbildungen 9, 10, Ergänzende Tabelle 5, siehe Referenzen 4,7,45, 46). Weitere Einstellungen finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 8. Multimapping-Regionen wurden ausgeschlossen, wenn sie sich mit der Bedmap BEDOPS47 um mehr als 50 % überlappten und mehr als dreimal auftraten. bedmap --count --echo --fraction-both 0.5 --delim '\t' prefiltered_megablast.bed | awk '$1<4' | Schnitt -f2- |sort-bed - | einzigartig. Verbleibende überlappende Regionen wurden mit bedops –merge zusammengeführt. Jede Region, die mit einem Exon um 1 bp oder mehr überlappt, wurde mithilfe von bedtools48 subtract ausgeschlossen. Um sich wiederholende Regionen auszuschließen, wurden Fasta-Sequenzen aus den gefilterten mutmaßlichen CNE-Positionen extrahiert und die Staubfunktion (Cut-off 10) des Memes49 wurde verwendet, um Wiederholungen zu maskieren. Darüber hinaus wurden für jeden Ähnlichkeitswert zwei Datensätze mit einer Mindestgröße von 100 bp bzw. 50 bp erstellt. Für Ähnlichkeitswerte von 0 % wurden nur 100-bp-Regionen beibehalten. Alle Regionen mit mehr als 25 % Ns wurden ausgeschlossen. Um alle verbleibenden kodierenden Sequenzen zu entfernen, wurden die verbleibenden mutmaßlichen CNE-Sequenzen mit der NCBI50 NR-Datenbank abgeglichen und alle Regionen, die mit einer BLAST-Übereinstimmung überlappten, wurden entfernt.

Die Vorbereitung und Analyse von ATAC-seq-Proben wird in der Ergänzenden Anmerkung 9 beschrieben. ATAC-seq wurde für die Stadien 20, 25 und 28/2940 mit jeweils zwei biologischen Replikaten generiert, wie in den Referenzen beschrieben. 25,51,52 mit leichten Änderungen. Jede ATAC-seq-Bibliothek wurde mit zwei biologischen Replikatproben erstellt. Die Proben wurden auf Illumina HiSeqV4 unter Verwendung von 125 bp Paired-End-Reads sequenziert. Die Lesevorgänge wurden mit BBDuk (https://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/bb-tools-user-guide/bbduk-guide/) getrimmt und den chromosomalen Gerüsten zugeordnet. Peaks wurden mit Genrich (https://github.com/jsh58/Genrich) aufgerufen. Nach dem Trimmen blieben zwischen 72 und 143 Millionen Messwerte übrig, die zwischen 79 und 83 % zugeordnet wurden, und für jede Probe wurden zwischen 22.443 und 36.933 Peaks aufgerufen.

Aus Eiern und Geleeschichten entnommene E. scolopes-Embryonen sowie Jungtiere wurden in 4 % EtOH in Meerwasser oder 4 % EtOH und MgCl2 (2 M Lösung langsam zu Meerwasser gegeben) anästhesiert und anschließend in 4 % Paraformaldehyd fixiert38. Interessante Sequenzen wurden anhand der Transkriptome von adulten E. scolopes identifiziert. cDNA gepoolter Entwicklungsstadien wurde für die PCR mit Q5-Polymerase verwendet. Die Produkte wurden in pjet-Vektoren kloniert und mit einem innuPREP Plasmid Mini Kit (Analytik jena (Jena, Deutschland)) isoliert und sequenziert. Ribosonden wurden aus amplifizierten Minipreps erzeugt und mit DIG-markierten Nukleotiden revers transkribiert. Einzelheiten zum FISH- und ISH-Protokoll finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 11. Embryonen und Jungtiere wurden auf einem invertierten konfokalen Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskop Zeiss (Oberkochen, Deutschland) LSM 780 abgebildet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die diese Studie stützen, sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Die Hi-C- und ATAC-seq-Daten wurden in der NCBI-Datenbank unter Bioproject PRJNA661684 hinterlegt. Alle Expressions-, ATAC-seq- und CNE-Daten, die dem Referenzgenom zugeordnet sind, sind in einem Genombrowser verfügbar (derzeit http://metazoa.csb.univie.ac.at:8000/euprymna/jbrowse oder auf Anfrage). Alle anderen verwendeten genomischen und traskriptomischen Daten wurden von NCBI heruntergeladen (GCA_002113885.2, GCA_000002075.2, GRCh38.p12, GCA_001949145.1 OLI-Apl_1.0, GCA_000003605.1, GCA_000224145.2, GCA_00000381). 5.1 Version 2, GCA_004765925.1 , Spur_3.1, GRCm38.p6, SAMN00691532, SAMN00152410), ENSEMBL (BDGP6.28 http://www.ensembl.org/Drosophila_melanogaster/Info/Index, WBcel235 http://m.ensembl.org/Caenorhabditis_elegans/Info/ Anmerkung, Capitella_teleta_v1.0 http://metazoa.ensembl.org/Capitella_teleta/Info/Index, ASM23792v2 http://metazoa.ensembl.org/Schistosoma_mansoni/Info/Index, oyster_v9 http://metazoa.ensembl.org/Crassostrea_gigas /Info/Index, Helro1 http://metazoa.ensembl.org/Helobdella_robusta/Info/Index, Lotgi1 http://metazoa.ensembl.org/Lottia_gigantea/Info/Index, PRJNA270931 https://metazoa.ensembl.org/ Octopus_bimaculoides/Info/Index, Stegodyphus_mimosarum_v1 [https://metazoa.ensembl.org/Stegodyphus_mimosarum/Info/Index], Tcas5.2 [http://metazoa.ensembl.org/Tribolium_castaneum/Info/Index, AMS_PRJEB1171_v1 [https:/ /metazoa.ensembl.org/Adineta_vaga/Info/Index, GRCh37.p13 https://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index, ASM20922v1 https://metazoa.ensembl.org/Nematostella_vectensis/Info/Index, Aqu1 https://metazoa.ensembl.org/Amphimedon_queenslandica/Info/Index, MneLei_Aug2011 http://metazoa.ensembl.org/Mnemiopsis_leidyi/Info/Index) oder GIGA (PRJNA421033 https://www.ebi.ac.uk/ena /browser/view/PRJNA421033). Humane Hi-C-Daten wurden von NCBI heruntergeladen (SRR1658570, HIC001). Auf die verarbeiteten Dateien und Tabellen, die zur Neuerstellung der Zahlen erforderlich sind, kann über ein Bitbucket-Repository zugegriffen werden: https://bitbucket.org/hannahschm/ceph_regulation_microsynteny/. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Alle bioinformatischen Protokolle werden unter https://bitbucket.org/hannahschm/ceph_regulation_microsynteny/ mit detaillierten Einstellungen für jedes Programm und Beispielskripten verfügbar gemacht. Das C++-Skript für 3D-Strukturen einzelner Chromosomen kann auf Anfrage bei T. Clarence ([email protected]) abgerufen werden.

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HS, OPH, ER und OS wurden durch das Stipendium P30686-B29 des Österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF) unterstützt. OS wurde vom Whitman Center Early Career Fellowship (Frank R. Lillie Quasi-Endowment Fund, L. & A. Colwin Summer Research Fellowship, Bell Research Award in Tissue Engineering) unterstützt. HS wurde durch das Kurzzeitstipendium (KWA) der Universität Wien gefördert. HS und OS wurden durch den University of Chicago/Vienna Strategic Partnership Program Mobility Grant unterstützt. AK wurde durch das JSPS Postdoctoral Fellowship for Overseas Researchers-Programm aus Japan unterstützt. CBA wurde vom Hibbitt Early Career Fellowship unterstützt. Eier und Paralarven von E. scolopes wurden teilweise mit Unterstützung der NASA erzeugt. Space Biology 80NSSC18K1465, vergeben an JSFSVN, wurde von der National Science Foundation IOS-1557914 unterstützt. Diese Arbeit wurde vom Francis Crick Institute unterstützt, das seine Hauptfinanzierung von Cancer Research UK (FC0001003), dem UK Medical Research Council (FC001003) und dem Wellcome Trust (FC001003) erhält. Die Autoren danken dem Wiener Tiergarten Schönbrunn, insbesondere Roland Halbauer und dem Aquaristik-Team für die Tierhaltung, sowie dem MBL Cephalopod Program, ihrem Team Emily Garcia und der MBL Central Microscopy Facility (MBL, Woods Hole). . Die Autoren danken dem Institut für Neurowissenschaften und Entwicklungsbiologie der Universität Wien, insbesondere Andreas Denner. Die Berechnung erfolgte mithilfe des Life Sciences Clusters der Universität Wien. Die Sektionierung erfolgte an der Core Facility CIUS (Universität Wien). Die Autoren danken Daniel Rokhsar und Clifton Ragsdale für ihre Anleitung und Ratschläge.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Hannah Schmidbaur, Akane Kawaguchi.

Institut für Neurowissenschaften und Entwicklungsbiologie, Universität Wien, Wien, Österreich

Hannah Schmidbaur, Oi Pui Hoang, Bob Zimmermann, Elena A. Ritschard und Oleg Simakov

Institut für Molekulare Pathologie, Wien, Österreich

Akane Kawaguchi & Elly Tanaka

Labor für biomolekulare Modellierung, Francis Crick Institute, London, Großbritannien

Tereza Clarence, Xiao Fu und Paul A. Bates

Abteilung für Biologie und Evolution mariner Organismen, Stazione Zoologica Anton Dohrn, Neapel, Italien

Elena A. Ritschard

Wiener Zoo, Maxingstraße 13b, 1130, Wien, Österreich

Anton Weißenbacher

Abteilung für Mikrobiologie und Zellwissenschaften, University of Florida, Space Life Science Lab, Merritt Island, FL, USA

Jamie S. Foster

Abteilung für Molekular- und Zellbiologie, University of Connecticut, Storrs, CT, USA

Spencer V. Nyholm

Bell Center for Regenerative Biology and Tissue Engineering, Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA, USA

von Caroline B. Albert

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HS führte mit Unterstützung von OS eine vergleichende Genomanalyse durch, AK führte Hi-C-Experimente durch, HS und AK führten eine ATAC-seq-Datenerfassung durch. HS und CA führten eine In-situ-Hybridisierung durch. TG, XF und PB führten eine 3D-Rekonstruktion und -Analyse durch. HS und OPH führten eine ATAC-seq-Quantifizierung durch. HS und BZ führten eine Koexpressions- und syntenische Randomisierungsanalyse durch, EAR, HS und CA führten eine RNA-seq-Extraktion durch. JF und SN lieferten Tiere. AW und der Wiener Zoo beherbergten Tiere. HS, CA, ET und OS haben die Forschung entworfen. HS und OS haben das Manuskript unter Mitwirkung aller anderen Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Caroline B. Albertin, Elly Tanaka oder Oleg Simakov.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Jose Martín-Durán und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schmidbaur, H., Kawaguchi, A., Clarence, T. et al. Entstehung einer neuen Genregulation und Expression von Kopffüßern durch groß angelegte Genomreorganisation. Nat Commun 13, 2172 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-29694-7

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Eingegangen: 19. August 2020

Angenommen: 28. März 2022

Veröffentlicht: 21. April 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-29694-7

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